Характеристика реассортантных штаммов вируса гриппа на основе нового донора A/HongKong/1/68/162/35(H3N2)

Полный текст

Общими требованиями для вирусов гриппа А - доноров генов внутренних и неструктурных белков, используемых для получения реассортантных вакцинных и производственных штаммов (для живых и инактивированных гриппозных вакцин), являются безопасность и иммуногенность. При получении вакцинных штаммов для живых гриппозных вакцин (ЖГВ) используются доноры аттенуации, обладающие двумя важными фенотипическими признаками - холодоадаптирован-ностью (са) и температурочувствительностью (ts). В настоящее время вакцинные штаммы для ЖГВ получают с использованием холодоадаптированнных доноров аттенуации: в России - А/Лен/17 и В/СССР/60/69, в США - А/Лпп Arbor/6/60 и В/Ann Arbor/1/66 [1, 3, 12]. В ряде лабораторий ведутся исследования с целью получения новых доноров для ЖГВ [11, 13]. Важнейшим свойством штамма-донора для получения инактивированных гриппозных вакцин (ИГВ) является высокая репродуктивность. Различия в требованиях к вакцинным штаммам для ЖГВ и ИГВ определяют существование доноров с разными свойствами. Разработанный в НИИ гриппа новый универсальный донор A/ HongKong/1/68/162/35(H3N2) [9] ориентирован на получение реассортантных штаммов как для ЖГВ, так и для ИГВ. Цель настоящей работы состояла в получении ре-ассортантных штаммов и исследовании способности донора передавать такие важные для вакцинных штаммов свойства, как безопасность, ts, са и высокая репродуктивность. Материалы и методы Вирусы. В работе использовали следующие вирусы: А/HongKong/1/68/162/35(Н3N2) - А/ГК/ХА-холодоадаптированный штамм, кандидат в доноры аттенуации и высокой репродуктивной активности; А/Санкт-Петербург/48/09(Н1Ш) - А/СПБ/48/09 -эпидемический вирус, антигенно схожий со штаммом А/BrisЪaiп/59/07(Н1N1), получен из коллекции вирусов ФГБУ НИИ гриппа; A/Perth/16/2009(Н3N2) - A/Perth/16/09 - эпидемический вирус, получен из Центра по контролю и профилактике инфекционных болезней (CDC), Атланта, США; А/Eauine/ Otar/764/07(Н3N8) - А/Otar/764/07 - штамм вируса гриппа лошадей, получен из НИИ проблем биологической безопасности, Республика Казахстан; A/Astana/6/05/PR8(UW) 2:6(H5N1) - А/Astana/PR -рекомбинантный штамм, созданный методом обратной генетики на основе донора PR8 и содержащий нейраминидазу (NA) и модифицированный гемагглю-тинин (НА) вируса A/chicken/Astana/6/05(H5N1) [10]. Реассортацию проводили классическим методом в 10-11-дневных развивающихся куриных эмбрионах (РКЭ) [2]. Состав генома реассортантов определяли методом ОТ-ПЦР и рестрикционного анализа, аналогично ранее описанной методике [5] с использованием специально подобранных праймеров и рестриктаз (табл. 1). Принадлежность NA определяли методом ОТ-ПЦР с типоспецифичными праймерами к различным субтипам. Принадлежность НА определяли в РТГА [8]. Температурочувствителъность и холодоадапти-рованность вирусов оценивали по результатам их параллельного титрования в РКЭ, при оптимальной (32oC), повышенной (39oC) и пониженной (26oC) температуре и выражали в виде разницы показателей инфекционной активности в lg ЭИД50/0,2 мл (соответственно RCT39 и RCT26). Штамм считали температурочувствительным, если RCT39 был более 5 lg ЭИД50/0,2 мл и холодоадаптированным, если RCT26 был не более 3 lg ЭИД50/0,2 мл. Подготовка прототипов вакцинных препаратов. Для получения прототипов ЖГВ накопленный вирусный материал реассортантных вирусов разводили фосфатно-солевым буфером (ФСБ) до концентрации 6,5 lg ЭИД50/мл. Препараты ИГВ получали методом изопикнического центрифугирования в градиенте плотности сахарозы. Инактивацию проводили 0,02% формалином. Содержание НА в вакцинных препаратах оценивали методом электрофореза в полиакриламидном геле с последующей денситометрией. Безопасность для экспериментальных животных оценивали на мышах линии Balb/c массой 18-20 г. Прототип ЖГВ вводили мышам интраназально двукратно с интервалом 2 нед в дозе 6,5 lg ЭИД50/50 мкл. На 3-и сутки после первой инокуляции оценивали репродукцию реассортантов в легких и носовых ходах мышей по показателям титрования 10% суспензии органов в куриных эмбрионах. Прототип ИГВ вводили внутрибрюшинно двукратно с интервалом 2 нед в дозе 10 мкг НА/мышь. Безопасность препаратов оценивали по динамике массы тела животных. Все работы с животными выполняли согласно Правилам проведения работ с использованием экспериментальных животных. Таблица 1 ОТ-ПЦР рестрикционный анализ для определения состава генома реассортантов на основе донора А/HongKong/1/68/162/35(Н3М2) и штаммов А/Санкт-Петербург/48/09 (H1N1), А/Equine/Otar/764/2007(Н3N8), A/Astana/6/05/PR8(UW) 2:6(H5N1) и А/Perth/ 16/09(H3N2) Ген Участок Наличие сайта рестрикции (позиция расщепления) а/гк/ха А/СПб/48/09 РВ2 2851-1264 EcoRI(1100) - РВ1 1237-1649 Hind III(1504) - PA 1474-2195 Ama87 I(1612) - NP 6-743 BamH I(262, 478) BamH I(478) M 551-957 Bsa29 I(845) - NS 342-882 - BslF I (585, 666) A/Otar/764/07 PB2 51-689 - EcoR I (540) PB1 1237-1649 Hind III(1504) - PA 1474-2195 BamH I(1242) - NP 6-743 BamH I(262, 478) - M 551-957 Bsa29 I(845) - NS 107-441 BslF I(130, 335) BslF I(130) A/Astana/PR PB2 851-1264 EcoR I(1100) - PB1 1237-1649 Hind III(1504) - PA 1141-1608 BamH I(1242) - NP 6-743 BamH I(262, 478) BamH I (478) M 551-957 Bsa29 I(845) - NS 107-441 BslF I(130, 335) A/Perth/16/09 PB2 851-1264 EcoR I(1100) - PB1 1237-1649 Hind III(1504) - PA 1141-1608 BamH I(1242) - NP 6-743 BamH I(262, 478) BamH I(478) M 551-957 Bsa29 I(845) - NS 107-441 BslF I(130, 335) BslF I(130) Рис. 1. Результаты электрофореза фрагментов генов РВ1, РВ2, PA, NP, М и NS клона 86 вируса A/Astana/ HK/2:6/2009 и контрольных образцов А/HongKong/1/68/162/35 (ИЕла) и Astana/PR8 (Ast). Последовательно нанесены фрагменты до и после (отмечено *) рестрикции. Рис. 2. Результаты электрофореза фрагментов генов РВ1, РВ2, PA, NP, М и NS клонов 28/2 и 28/3 вируса А/Отар/ НК/2:6/2009 и контрольных образцов А/HongKong/1/68/162/35 (НК) и А/Отар/746/07/ (От). Последовательно нанесены фрагменты до и после (отмечено *) рестрикции. Также представлены результаты ОТ-ПЦР с типоспецифичными праймерами к различным субтипам NA. Таблица 2 Характеристика репродуктивных свойств реассортантов на основе донора A/HongKong/1/68/162/35 и их стабильности Вирус Инфекционная активность, lg ЭИД50/0,2 мл, при RCT26 RCT 39 Гемаг глютини рующая активность, ГАЕ50/мкл После 5 пассажей в РКЭ Фенотип 26oC 32oC 39oC RCT26 RCT39 гемагглютини-рующая активность, ГАЕ50/мл А/HongKong/68/162/35 8,5-9,5 9,0-10,0 1,5 0,5 7,5 1024-2048 1,5 7,5 1024-2048 ts-, са- А/Санкт-Петербург/48/09 4,0 8,25 3,75 4,25 4,5 256 non-ts-, non-ca- А/СПб/HK/2:6/09-реассортант 6,5 9,3 1,5 2,8 7,8 512-1024 2,5 7,0 512-1024 ts-, са- A/Perth/16/2009 2,0 6,0 1,5 4,0 4,5 128 non-ts-, non-ca- А/Perth/HK/2:6/2011-реассортант 7,75 9,5 0,5 1,25 9,0 512 1,5 8,0 512 ts-, са- A/Astana/6/05/PR8(UW) 2:6 3,5 9,5 8,5 6,0 1,0 1024 non-ts-, non-ca- А/Astana/HK/2:6/2009- 7,5 9,5 3,5 2,0 6,0 1024 0,5 7,75 1024 ts-, caреассортант А/Equina/Otar/764/07 2,5 7,5 5,5 5,0 2,0 256 non-ts-, non-ca- А/Otar/HK2:6/2010-реассортант 9,0 9,5 1,5 0,5 8,0 512-1024 1,0 8,0 1024 ts-, ca- Результаты и обсуждение Биологические свойства реассортантных штаммов, полученных на основе одного и того же донора, могут в значительной степени варьировать в зависимости от соотношения родительских генов [6]. В данном исследовании использовали реассортанты с одинаковой структурой генома 6:2 (6 генов, кодирующих внутренние и неструктурные белки, от донора А/ГК/ХА и 2 гена, кодирующих поверхностные белки, от эпидемических штаммов). На основе штамма А/ГК/ХА были получены реассортанты с актуальными эпидемическими вирусами А/СПб/48/09 и A/Perth/16/09, а также с эпизоотическим штаммом А/Otar/764/07 и рекомбинантным штаммом А/Astana/PR. В табл. 1 представлены итоговые схемы рестрикционного анализа. Исследование состава генома реас-сортантных штаммов показано на примере штаммов А/Astana/HK/09 и А/Otar/HK/10 (рис. 1 и 2). Реассортанты, полученные на основе донора А/ГК/ ХА, показали высокую репродуктивную активность в РКЭ (табл. 2). Инфекционная активность достигала 9,3-9,5 lg ЭИД50/0,2 мл, гемагглютинирующая - 512-1024 ГАЕ /мкл. Все реассортанты приобрели ts-, са-фенотип. После 5-кратного пассирования в системе РКЭ реассортанты сохранили фенотипические характеристики, присущие исходным вариантам, что свидетельствует о стабильности приобретенных ре-ассортантами свойств. Показатели RCT26 колебались в пределах 0,5-2,5 lg ЭИД /0,2 мл, RCT - в пределах 7,0-8,0 lg ЭИД50/0,2 мл. Таблица 3 Характеристика безвредности и инфекционности реассортантов на основе донора A/HongKong/1/68/162/35 Вирус Репродукция в легких, lg ЭИД^/мл Репродукция в носовых ходах, lg ЭИД^/мл Максимальная потеря веса, % Летальность, % А/HongKong/1/68/162/35 2,75 ± 0,2 5,5 ± 0,3 0 0 А/Санкт-Петербург/48/09 4,25 ± 0,3 2,5 ± 0,2 1 0 А/СПб/HK/2:6/09-реассортант 0,5 ± 0,0 0,75 ± 0,1 0,5 0 A/Astana/6/05/PR8(UW)2:6 5,0 ± 0,2 2,5 ± 0,1 30 100 A/Astana/HK/2:6/2009-реассортант 1,5 ± 0,2 0,75 ± 0,1 1 0 А/Equina/Otar/764/07 5,75 ± 0,3 4,25 ± 0,3 25 10 A/Otar/HK/2:6/2010-реассортант 1,75 ± 0,1 2,5 ± 0,2 2 0 Изучение безвредности прототипов ЖГВ показало, что все реассортантные штаммы не были патогенным для мышей при интраназальном введении, т. е. не вызывали снижение массы тела и развитие клинических симптомов инфекции, в то время как “дикие” родительские штаммы и штамм А/Astana/PR вызывали заметное снижение массы тела (до 25-30%), проявление клинических признаков заболевания и даже гибель животных (табл. 3). Уровень репродукции реассортантов в легких снижался по сравнению с родительскими штаммами на 3,5-4,0 lg ЭИД50/мл. Показатель репродукции в носовых ходах мышей составлял 0,75-2,5 lg ЭИД50/мл. Несмотря на то что уровень репродукции вируса А/Astana/HK в легких был незначительно выше, чем уровень репродукции в верхних дыхательных путях, среди мышей отсутствовала летальность и уровень снижения массы тела не превышал 1%. Результаты исследования безвредности и репродукции в дыхательных путях мышей реассортанта А/Astana/HK коррелируют с литературными данными, касающимися оценки безопасности вакцинных штаммов H5N1 [4, 7]. Значительное снижение репродуктивной активности реассортантов на основе холодоадаптированного донора А/ГК/ХА в легких мышей и способность к репродукции в носовых ходах подтверждают аттенуированный фенотип вируса для мышей. Внутрибрюшинное введение прототипов ИГВ также не приводило к появлению каких-либо симптомов заболевания. Все животные остались живы, максимальное снижение не превышало 1,5%. Таким образом, показано, что гены внутренних и неструктурных белков высокорепродуктивного донора аттенуации А/ГК/ХА повышают репродукцию полученных на его основе реассортантов по сравнению с дикими штаммами. Реассортанты наследуют от донора ts-, са-фенотип и сохраняют биологические свойства после 5-кратного пассирования в куриных эмбрионах. В результате исследования безвредности прототипов препаратов ЖГВ и ИГВ на основе реас-сортантных штаммов у лабораторных животных не обнаружены признаки патогенности и токсичности. Полученные данные позволяют рассматривать вирус гриппа A/HongKong/1/68/162/35(H3N2) в качестве кандидата в универсальные доноры аттенуации и высокой репродуктивности.

Список литературы

Дополнительные файлы