Способность малых интерферирующих РНК-олигонуклеотидов снижать инфекционную активность вируса гепатита С в культурах клеток

Полный текст

Гепатит С является одной из наиболее серьезных проблем здравоохранения в глобальном масштабе. По консервативным оценкам, во всем мире вирусом гепатита С (HCV, Hepatitis C virus) инфицировано около 170 млн человек с ежегодным приростом числа инфицированных от 3 до 4 млн [1, 6]. Возбудителем инфекции является HCV, относящийся к семейству Flavi-viridae [6]. В 85% случаев ВГС вызывает хроническое заболевание, которое в дальнейшем может приводить к циррозу печени, а также к хроническому поражению многих органов и тканей человека, а впоследствии - к развитию гепатоцеллюлярной карциномы [1, 6]. Основными препаратами для лечения гепатита C являются интерфероны в сочетании с рибавирином (виразол). В зависимости от влияния различных факторов, связанных с особенностями вируса или течением инфекции у пациента, эффективность такого комбинированного лечения не превышает 40-60%. Невысокая эффективность лечения усугубляется побочным действием препаратов: интерфероны вызывают длительное и выраженное общее недомогание и депрессию, а применение рибавирина ведет к появлению гемолитической анемии. Таким образом, в настоящее время остро встает вопрос поиска альтернативных путей терапии ВГС-инфекции, решение которого в течение длительного времени было затруднено из-за недоступности надежных моделей инфекции, вызванной ВГС в клеточных культурах, необходимых для доклинических испытаний противовирусной активности соединений. Впервые созданная нами лабораторная модель инфекции, вызванной ВГС в культурах клеток, открыла перспективу для широкого скрининга соединений с целью поиска альтернативных путей лечения ВГС-инфекции [2-5]. В последние годы в мире наметилось динамично развивающееся направление в лечении вирусных инфекций [8, 9], связанное с применением метода РНК-интерференции [7]. Данный метод основан на специфическом распознавании РНК-мишени с помощью специально сконструированных малых (19-22 пары оснований) интерферирующих РНК-олигонуклеотидов (миРНК, или siRNA). Попадая внутрь клетки, миРНК образуют комплекс с мРНК-мишенью на уровне комплементарного взаимодействия. Это приводит к нарушению синтеза вирусных белков на мРНК-матрице и подавлению сборки вирусных белков (см. рисунок). Метод РНК-интерференции позволяет точно подобрать РНК-олигонуклеотиды, подобно праймерам в ПЦР, для нужных участков мРНК. Цель данной работы - изучить противовирусную активность сконструированных миРНК в отношении инфекции, вызванной ВГС в культурах клеток. Материалы и методы Культуры клеток. Для изучения противовирусной активности сконструированных миРНК использовали чувствительные к репродукции ВГС перевиваемые культуры клеток почки эмбриона свиньи (СПЭВ). Культуры выращивали в виде 2-дневного монослоя в 48-луночных пластиковых культуральных панелях на среде 199 (производство НИИ полиомиелита и вирусных энцефалитов им. М. П. Чумакова РАМН) с добавлением 100 ЕД/мл пенициллина и стрептомицина и 10% сыворотки крупного рогатого скота. Вирус. В исследованиях использовали цитопато-генный вариант ВГС штамм С-13 [2-4]. Этот вариант вируса выделен из сыворотки крови больной хроническим гепатитом С, положительной на РНК ВГС (генотип 1b). В работе использовали ВГС-содержащую культуральную жидкость, собранную из инфицированных культур клеток СПЭВ в стадии цитодеструкции; инфекционный титр ВГС составлял 8,0 lg ТЦД/мл. Малые интерферирующие РНК (миРНК). Подбор последовательностей миРНК ВГС осуществляли посредством сравнительного анализа наиболее консервативных участков генома ВГС. Подобранные миРНК позволяют взаимодействовать с областью III домена на 5’-UTR области генома ВГС. РНК-нуклеотиды этой области формируют петлевые структуры, распознающие 40S-домен внутриклеточных рибосом и отвечают за инициацию трансляции вирусных белков. Последовательность нуклеотидов в этой области является наиболее консервативной среди абсолютного большинства вариантов ВГС, позволяя таким образом использовать данные миРНК для дальнейшей терапии ВГС независимо от субтипов ВГС. Синтезированные миРНК для мишени представляют собой 2 нити длиной 19-21 пара оснований в виде смысловой и антисмысловой нити (смысловая: GUACUGCU-GAUAGGGUGCdTdT, антисмыс-ловая: GCACCCUAUCA GGCA-GUACdTdT). Перед проведением трансфекции из нитей получали дуплексы, которые обеспечивают устойчивость миРНК для внутриклеточных нуклеаз. На концах 3’ - концах РНК-дуплексов имеются по два выступающих дезокси-T (dTdT), которые распознаются внутриклеточными нуклеазами. Трансфекция миРНК в клетки, инфицированные ВГС. Трансфекция миРНК проводилась с помощью липофектамина с использованием набора для трансфекции (RNAiM-AX, “Invitrogen”) интерферирующих РНК, предназначенного для клеточных линий, живущих в виде монослоя клеток. С этой целью культуры клеток СПЭВ рассеивали в лунки двух 48-луночных культуральных планшет за 2 сут до трансфекции. При этом посевную концентрацию клеток рассчитывали таким образом, чтобы на следующий день в лунках был сформирован монослой клеток, покрывающий не более 50% дна лунки. За 1 сут до трансфекции в лунках с монослоем клеток меняли питательную среду на среду поддержки (с содержанием 1% сыворотки, без антибиотиков). Затем выделяли контрольные лунки с монослоем клеток: а) без добавления миРНК, не зараженные ВГС (контроль клеток); б) культура клеток, инфицированные вирусом, без добавления миРНК (контроль вируса); в) культуры клеток, трансфицированные миРНК, неинфицированные ВГС (контроль препарата, в частности его способность индуцировать цитотоксиче-ский эффект). В опытных лунках с монослоем клеток СПЭВ за 1 ч до трансфекции миРНК клетки были инфицированы ВГС в дозах 1,0; 0,1 и 0,01 ТЦД50/клет-ка. После 1 ч инкубации неадсорбировавшийся вирус из лунок был удален и к монослою клеток добавляли смеси миРНК с липофектамином в режиме прямой трансфекции в соответствии с протоколом. Приготовление смесей с липофектамином проводили в соответствии с инструкцией набора. Конечная концентрация миРНК в лунках составляла 4 нМ и более. S - цепь 19-нуклеотидный дуплекс 5’ -I—L з’ Т~Г 5' i_i 2 свисающих нуклеотида .AS - цепь Трансфекция Малые интерферирующие РНК (миРНК) (вверху рисунка) представляют собой РНК-РНК-дуплекс в виде двух цепей -- смысловой S и антисмысловой AS. Цепи синтезируют искусственно и затем гибридизуют друг с другом таким образом, чтобы сформировался дуплекс с неспаренными 3’-концами; они служат для распознавания дуплекса внутриклеточными эндонуклеазами. МиРНК доставляют в инфицированную клетку с использованием метода трансфекции. Внутри клетки миРНК расщепляются белком Argonaute, после чего антисмысловая AS в составе белкового комплекса RISC (RNA Induced Silencing Complex) комплементарно взаимодействует с вирусной мРНК, что блокирует трансляцию последней и в конечном счете приводит к ее деградации. Механизм РНК-интерференции в клетке. Результаты учитывали двумя способами: оценивали влияние миРНК на жизнеспособность клеток, инфицированных ВГС; определяли титр ВГС в пробах сре- Влияние миРНк на выживаемость клеток, инфицированных ВГС Варианты опыта Погибшие инфицированные ВГС клетки в монослое в зависимости от трансфекции миРНК, % 1 1 1 кв кв кв Доза 0,01 ТЦД50/ лунка 0 0 0 5 5 5 Доза 0,1 ТЦД50/ лунка 0 0 0 100 100 100 Доза 1,0 ТЦД50/ 80 90 85 100 100 100 лунка Примечание. Здесь и в табл. 2: 1 - 4 нмоль миРНК дуплекса; кв - культуры клеток, инфицированные ВГС без добавления миРНК. Таблица 2 Влияние миРНк на способность клеток, инфицированных ВГС, продуцировать инфекционный для культур клеток СПЭВ вирус через 48 ч после заражения и внесения препаратов Варианты опыта Титр вируса гепатита C в lg ТЦД50 для клеток СПЭВ в среде инфицированных культур клеток через 48 ч после заражения клеток и трансфекции миРНК 1 1 1 кв кв кв Доза 0,01 ТЦД50/лунка 0 0 0 1,5 2,0 1,5 Средние данные 0 1,7 Доза 0,1 ТЦД50/лунка 0 0 3,0 7,2 7,0 7,1 Средние данные 1,0 7,1 Доза 1,0 ТЦД50/лунка 6,9 7,0 7,1 7,1 7,2 7,0 Средние данные 7,0 7,1 ды, отобранных из лунок с монослоем клеток СПЭВ через 48 ч после заражения ВГС. Результаты и обсуждение До сих пор из наиболее серьезных проблем, связанных с гепатитом C, является создание и разработка современных и эффективных способов лечения этой инфекции, характеризующейся чаще всего скрытым течением, серьезными последствиями для организма и необычайной вариабельностью генома вируса, что создает большие сложности в поиске средств эффективного лечения гепатита С. В последние несколько лет большой интерес фармакологов направлен на новый способ борьбы с РНК-содержащими вирусами, который получил название РНК-интерференции. Представляло интерес изучить возможность подавления репликации ВГС с использованием миРНК, способных взаимодействовать с геномом ВГС. Проводили также исследование цитотоксичности миРНК. Получены данные, свидетельствующие об отсутствии цитотоксических свойств у миРНК в используемых концентрациях. Данные табл. 1 и 2 указывают на способность миРНК защищать инфицированные ВГС клетки от цитопатогенного действия вируса. Получены также данные, свидетельствующие о способности миРНК снижать инфекционную активность ВГС, продуцируемого каультурами клеток СПЭВ в ранних стадиях инфекции. В опытах были использованы разные дозы ВГС, применяемые для заражения культур клеток СПЭВ. Показано, что оптимальной дозой вируса является доза 0,1 ТЦД50/лунка, при которой были получены наиболее отличимые результаты изучения активности миРНК (см. табл. 1 и 2). Сходные данные были получены при изучении способности РНК-олигонуклеотидов снижать инфекционные титры ВГС, продуцируемые клетками СПЭВ в ранних стадиях инфекции (см. табл. 2). Обнаружено, что в опытах, в которых использовали ВГС в дозе 0,1 ТЦД/лунка, продукция ВГС трансфицированными миРНК снижалась более чем на 6,0 lg (максимальный эффект, средние данные). Показано, что при высоких дозах заражения клеток СПЭВ противовирусный эффект отсутствовал, а при низких дозах заражения обнаружено полное подавление продукции ВГС клетками, содержащих миРНК. Результаты, представленные в табл. 2, в определенной степени согласуются с результатами исследования способности олигонуклеотидов защищать инфицированные ВГС клетки от цитопатогенного действия вируса (см. табл. 1). Таким образом, в результате исследований получены данные, свидетельствующие о способности РНК-олигонуклеотидов снижать инфекционную активность продуцируемого клетками СПЭВ ВГС и защищать инфицированные культуры клеток от цитопа-тогенного действия вируса. Ранее в проведенных нами экспериментальных исследованиях in vitro было показано, что обработка клеток, инфицированных ВГС, интерфероном альфа (основной препарат, используемый в настоящее время для лечения гепатита С) приводила к снижению продукции ВГС клетками приблизительно на 2,0 lg ТЦД50 [5]. Таким образом, противовирусный эффект интерферона в значительной мере уступает способности РНК-олигонуклеотидов подавлять продукцию инфекционного ВГС in vitro, что явно свидетельствует о перспективе использования миРНК как противовирусных соединений.

Список литературы

Дополнительные файлы