Репродукция вируса гриппа в клетках эндотелия кровеносных сосудов человека

Аннотация

Современные эпидемические штаммы вирусов гриппа подтипов H5N1, H3N2, H1N1 способны репродуцироваться в культуре клеток эндотелия человека EAhy926 с инфекционной активностью 3,0-4,5 lg ТЦД 50. Эти данные подтверждаются данными регистрации НА и NP-белков вируса гриппа в эндотелии кровеносных сосудов легких при анализе аутопсийного материала пациентов, умерших от гриппа во время эпидемии 2009-2010 гг. Полученные результаты отражают новый аспект патогенеза гриппа для разработки противовирусных препаратов и комплексной терапии.

Полный текст

Общеизвестно, что вирус гриппа поражает не только респираторный тракт, но и другие органы, такие как кишечник, мозг, сердце и кровеносные сосуды [2, 5, 6, 11]. В последние годы получены данные о том, что ежегодные эпидемии гриппа сопровождаются подъемом сердечно-сосудистых заболеваний, в связи с чем сформулирована гипотеза, что эпидемия “испанки” в 1918-1920 гг. могла играть определенную роль в последующем росте частоты заболеваний сердца и сосудов [10]. Клинические исследования, проводимые в период 2005-2009 гг., когда летальность от гриппа была невысока и в основном приходилась на людей пожилого возраста, также показали, что фатальная гриппозная инфекция сопровождалась сердечно-сосудистой недостаточностью (50%) и дыхательной дисфункцией в связи с геморрагическим характером пневмоний, что могло быть следствием повреждений эндотелия сосудов [1, 3, 4]. Особую актуальность вопрос о повреждающем действии вируса гриппа на эндотелий сосудов приобрел во время эпидемии “свиного” гриппа H1N1 из-за высокой летальности от геморрагических пневмоний [12]. Поскольку этот аспект патогенеза гриппозной инфекции практически не изучен, целью настоящего исследования явилась оценка способности вирусов гриппа типа А репродуцироваться в эндотелии кровеносных сосудов человека. Материалы и методы Вирусы. Исследовали вирусы гриппа А/ Brisbane/10/2007 (H3N2), А/Курган/5/05 NS1-81/5:3 (H5N1) и А/Санкт-Петербург/2/2009 (H1N1v). Все вирусы получены из Лаборатории этиологии НИИ гриппа СЗО РАМН. Клеточные культуры. Репродукцию изучали на культуре клеток эндотелия человека EAhy926, любезно предоставленной д-ром Корой Джин Эйджел из Отдела патологии Университета Северной Каролины. Репродукция вируса гриппа A в клетках эндотелия EAhy926 и MDCK Вирусы гриппа Инфекционный титр вируса, lg ТЦД50/мл, через 72 ч после заражения Титр в РГА (с 1% куриными эритроцитами) EAhy926 MDCK EAhy926 MDCK A/Brisbane/10/2007 (H3N2) 3,50 5,23 1/128 1/1024 А/Курган/5/05/Ш1-81/5:3 (H5N1) 3,48 4,55 1/64 1/128 А/Санкт-Петербург/2/2009 (H1N1v) 4,16 5,50 1/128 1/256 Контактная информация: Жилинская Ирина Николаевна, д-р биол. наук; e-mail:irina@influenza.spb.ru Рис. 1. Электронограмма эндотелиальных клеток EAhy926, инфицированных вирусом гриппа (через 24 ч после заражения). а - интактные клетки; б - клетки, инфицированные вирусом A/Brisbane/10/2007 (H3N2); в - клетки, инфицированные вирусом А/Курган/5/05/ NS1-81/5:3 (H5N1); г - клетки, инфицированные вирусом А/Санкт-Петербург/2/2009 (H1N1v). Я - ядро; М - митохондрия; ШЭР - шероховатый эндоплазматический ретикулум; В - вакуоль с вирусоподобными частицами. Рис. 2. Иммуногистохимический анализ локализации HA и NP вируса гриппа A(H1N1v) в аутопсийном материале легких пациентов. а - контроль на отсутствие реакции МКА с НА; б - контроль на отсутствие реакции МКА с NP; в - локализация НА в клетках эндотелия сосудов, альвеолярного эпителия, тканевых макрофагах; г - локализация NP в клетках эндотелия сосудов и тканевых макрофагах. Э ^ эндотелий; А ^ альвеолярный эпителий; ТМ ^ тканевой макрофаг. (Ув. 100 с иммерсией; окрашивание клеток ДАБ-хромагеном с последующей окраской гематоксилином Майера). Клеточную линию EAhy926 поддерживали в среде DMEM/F-12 с Хепесом и L-глутамином, содержащей 10% сыворотки эмбрионов коров (“Биолот”, Санкт-Петербург). Для сравнения была взята культура клеток MDCK из коллекции клеточных культур НИИ гриппа СЗО РАМН, культивируемая по общепринятой методике. Заражение клеточного монослоя проводили путем адсорбции вируса при 37oC в атмосфере 5% CO2 (инкубатор фирмы «SANYO”, Япония) в поддерживающей среде DMEM, содержащей 2 мкг/мл трипсина ТРСК. Через 1 ч после адсорбции клетки отмывали и инкубировали в той же среде в течение 72 ч. Определение инфекционной активности вируса гриппа в культуре клеток. Инфекционную активность вирусов гриппа определяли титрованием вируссодержащего материала в суточной культуре EAhy926 и суточной культуре MDCK с коэффициентом 10 и рассчитывали методом Рида и Менча (1938). Инфекционную активность вирусов оценивали по ТЦД50 и в реакции гемагглютинации (РГА) с куриными эритроцитами общепринятым методом через 72 ч после заражения. Электронная микроскопия. Электронно-микроскопический анализ клеточной культуры EAhy926, ин-тактной и инфицированной вирусами гриппа А (доза заражения вирусами 100 ТЦД/культура (106 клеток); время репродукции вируса 24 ч), был выполнен на микроскопе JeM-1011. Клетки фиксировали в 2% глута-ральальдегиде на 0,1 М какодилатном буфере (рН 7,4) в течение 1 ч при комнатной температуре, постфикси-ровали в 1% четырехокиси осмия на том же буфере в аналогичных температурных условиях. Материал обезвоживали в этаноле восходящей концентрации и заключали в смесь эпона и аралдита. Ультратонкие срезы изготавливали на ультратоме LKB-100. Иммуногистохимический анализ аутопсийного материала легких. Аутопсийный материал легких от пациентов, умерших во время эпидемии 2009-2010 гг., был предоставлен Ленинградским областным патолого-анатомическим бюро Санкт-Петербурга. Анализировали ткани легких методом иммуногистохимии с моноклональными антителами (МКА) к ге-магглютинину (НА) и нуклеопротеину (NP) вируса гриппа и выявляли их с помощью систему визуализации фирмы “Novolink” (Novocastra), включающей реакцию с ДАБ-хромогеном. МКА к НА вируса гриппа H1N1v и к NP-белку вируса гриппа A были получены в лаборатории биотехнологии диагностических препаратов НИИ гриппа СЗО РАМН. В качестве контроля был использован ау-топсийный материал легких от пациентов, умерших с признаками прогрессирующей легочной дисфункции и явлениями острого респираторного дистресс-синдрома, не имевших диагноза “грипп”, Результаты и обсуждение Изучение репродукции вируса гриппа в культуре клеток EAhy926. Как видно из таблицы, исследуемые вирусы были способны инфицировать клеточную культуру EAhy926. Однако инфекционный титр вируса в клетках эндотелия и титр в РГА был ниже, чем в культуре клеток MDCK, которая является пермиссивной культурой для вируса гриппа. Возможно, это объясняется особенностями физиологии эндотелиальных клеток. Наши данные совпадают с данными H. Klenk [9], A. Feldmann и соавт. [8], M. Chan и соавт. [7], показавших способность вируса чумы птиц и вирусов гриппа H5N1 и H1N1, выделенных в 1997-1998 гг., репродуцироваться в клетках эндотелия куриных эмбрионов и первичной культуре клеток эндотелия легких. Электронно-микроскопический анализ морфологии эндотелиальной клеточной культуры EAhy926. Как видно из рис. 1, б, в, г, в клетках, инфицированных исследуемыми вирусами, отмечено увеличение количества диктиосом и расширение цистерн аппарата Гольджи, а также увеличение количества шероховатого эндоплазматического ретикулума. Кроме этого, в инфицированных клетках наблюдали увеличение количества миелоидных телец и обнаруживали вакуоли с вирусоподобными частицами. Все это указывает на наличие в исследуемых клетках вирусной инфекции. Иммуногистохимический анализ аутопсийного материала из легких пациентов, умерших во время эпидемии 2009-2010 гг. Для подтверждения возможности репродукции вируса гриппа в эндотелии был проведен иммуногистохимический анализ аутоп-сийного материала легких 8 пациентов, умерших во время эпидемии 2009-2010 гг. Как видно на рис. 2, в, НА вируса гриппа H1N1v локализовался на плазматической мембране и в цитоплазме клеток эндотелия мелких кровеносных сосудов, клеток альвеолярного и бронхиолярного эпителия и внутри альвеолярных и тканевых макрофагов. NP-антиген этого вируса (см. рис. 2, г) регистрировали в тех же клетках и тканях, что и НА, но NP был локализован в ядрах клеток, что отражает особенности репродукции вируса гриппа. Все описанные выше этапы исследования показали, что вирус гриппа может полноценно репродуцироваться в эндотелии кровеносных сосудов и вызывать повреждение его клеток. С нашей точки зрения эти результаты исследования репродукции вирусов гриппа типа А (подтипы H3N2, H5N1, H1N1v 2009 г. выделения) представляются чрезвычайно важными для изучения патогенеза гриппозной инфекции и разработки новых подходов к лечению гриппа и созданию этиотропных комплексных противогриппозных препаратов.