Репродукция вируса гриппа в клетках эндотелия кровеносных сосудов человека


Цитировать

Полный текст

Аннотация

Современные эпидемические штаммы вирусов гриппа подтипов H5N1, H3N2, H1N1 способны репродуцироваться в культуре клеток эндотелия человека EAhy926 с инфекционной активностью 3,0-4,5 lg ТЦД 50. Эти данные подтверждаются данными регистрации НА и NP-белков вируса гриппа в эндотелии кровеносных сосудов легких при анализе аутопсийного материала пациентов, умерших от гриппа во время эпидемии 2009-2010 гг. Полученные результаты отражают новый аспект патогенеза гриппа для разработки противовирусных препаратов и комплексной терапии.

Полный текст

Общеизвестно, что вирус гриппа поражает не только респираторный тракт, но и другие органы, такие как кишечник, мозг, сердце и кровеносные сосуды [2, 5, 6, 11]. В последние годы получены данные о том, что ежегодные эпидемии гриппа сопровождаются подъемом сердечно-сосудистых заболеваний, в связи с чем сформулирована гипотеза, что эпидемия “испанки” в 1918-1920 гг. могла играть определенную роль в последующем росте частоты заболеваний сердца и сосудов [10]. Клинические исследования, проводимые в период 2005-2009 гг., когда летальность от гриппа была невысока и в основном приходилась на людей пожилого возраста, также показали, что фатальная гриппозная инфекция сопровождалась сердечно-сосудистой недостаточностью (50%) и дыхательной дисфункцией в связи с геморрагическим характером пневмоний, что могло быть следствием повреждений эндотелия сосудов [1, 3, 4]. Особую актуальность вопрос о повреждающем действии вируса гриппа на эндотелий сосудов приобрел во время эпидемии “свиного” гриппа H1N1 из-за высокой летальности от геморрагических пневмоний [12]. Поскольку этот аспект патогенеза гриппозной инфекции практически не изучен, целью настоящего исследования явилась оценка способности вирусов гриппа типа А репродуцироваться в эндотелии кровеносных сосудов человека. Материалы и методы Вирусы. Исследовали вирусы гриппа А/ Brisbane/10/2007 (H3N2), А/Курган/5/05 NS1-81/5:3 (H5N1) и А/Санкт-Петербург/2/2009 (H1N1v). Все вирусы получены из Лаборатории этиологии НИИ гриппа СЗО РАМН. Клеточные культуры. Репродукцию изучали на культуре клеток эндотелия человека EAhy926, любезно предоставленной д-ром Корой Джин Эйджел из Отдела патологии Университета Северной Каролины. Репродукция вируса гриппа A в клетках эндотелия EAhy926 и MDCK Вирусы гриппа Инфекционный титр вируса, lg ТЦД50/мл, через 72 ч после заражения Титр в РГА (с 1% куриными эритроцитами) EAhy926 MDCK EAhy926 MDCK A/Brisbane/10/2007 (H3N2) 3,50 5,23 1/128 1/1024 А/Курган/5/05/Ш1-81/5:3 (H5N1) 3,48 4,55 1/64 1/128 А/Санкт-Петербург/2/2009 (H1N1v) 4,16 5,50 1/128 1/256 Контактная информация: Жилинская Ирина Николаевна, д-р биол. наук; e-mail:irina@influenza.spb.ru Рис. 1. Электронограмма эндотелиальных клеток EAhy926, инфицированных вирусом гриппа (через 24 ч после заражения). а - интактные клетки; б - клетки, инфицированные вирусом A/Brisbane/10/2007 (H3N2); в - клетки, инфицированные вирусом А/Курган/5/05/ NS1-81/5:3 (H5N1); г - клетки, инфицированные вирусом А/Санкт-Петербург/2/2009 (H1N1v). Я - ядро; М - митохондрия; ШЭР - шероховатый эндоплазматический ретикулум; В - вакуоль с вирусоподобными частицами. Рис. 2. Иммуногистохимический анализ локализации HA и NP вируса гриппа A(H1N1v) в аутопсийном материале легких пациентов. а - контроль на отсутствие реакции МКА с НА; б - контроль на отсутствие реакции МКА с NP; в - локализация НА в клетках эндотелия сосудов, альвеолярного эпителия, тканевых макрофагах; г - локализация NP в клетках эндотелия сосудов и тканевых макрофагах. Э ^ эндотелий; А ^ альвеолярный эпителий; ТМ ^ тканевой макрофаг. (Ув. 100 с иммерсией; окрашивание клеток ДАБ-хромагеном с последующей окраской гематоксилином Майера). Клеточную линию EAhy926 поддерживали в среде DMEM/F-12 с Хепесом и L-глутамином, содержащей 10% сыворотки эмбрионов коров (“Биолот”, Санкт-Петербург). Для сравнения была взята культура клеток MDCK из коллекции клеточных культур НИИ гриппа СЗО РАМН, культивируемая по общепринятой методике. Заражение клеточного монослоя проводили путем адсорбции вируса при 37oC в атмосфере 5% CO2 (инкубатор фирмы «SANYO”, Япония) в поддерживающей среде DMEM, содержащей 2 мкг/мл трипсина ТРСК. Через 1 ч после адсорбции клетки отмывали и инкубировали в той же среде в течение 72 ч. Определение инфекционной активности вируса гриппа в культуре клеток. Инфекционную активность вирусов гриппа определяли титрованием вируссодержащего материала в суточной культуре EAhy926 и суточной культуре MDCK с коэффициентом 10 и рассчитывали методом Рида и Менча (1938). Инфекционную активность вирусов оценивали по ТЦД50 и в реакции гемагглютинации (РГА) с куриными эритроцитами общепринятым методом через 72 ч после заражения. Электронная микроскопия. Электронно-микроскопический анализ клеточной культуры EAhy926, ин-тактной и инфицированной вирусами гриппа А (доза заражения вирусами 100 ТЦД/культура (106 клеток); время репродукции вируса 24 ч), был выполнен на микроскопе JeM-1011. Клетки фиксировали в 2% глута-ральальдегиде на 0,1 М какодилатном буфере (рН 7,4) в течение 1 ч при комнатной температуре, постфикси-ровали в 1% четырехокиси осмия на том же буфере в аналогичных температурных условиях. Материал обезвоживали в этаноле восходящей концентрации и заключали в смесь эпона и аралдита. Ультратонкие срезы изготавливали на ультратоме LKB-100. Иммуногистохимический анализ аутопсийного материала легких. Аутопсийный материал легких от пациентов, умерших во время эпидемии 2009-2010 гг., был предоставлен Ленинградским областным патолого-анатомическим бюро Санкт-Петербурга. Анализировали ткани легких методом иммуногистохимии с моноклональными антителами (МКА) к ге-магглютинину (НА) и нуклеопротеину (NP) вируса гриппа и выявляли их с помощью систему визуализации фирмы “Novolink” (Novocastra), включающей реакцию с ДАБ-хромогеном. МКА к НА вируса гриппа H1N1v и к NP-белку вируса гриппа A были получены в лаборатории биотехнологии диагностических препаратов НИИ гриппа СЗО РАМН. В качестве контроля был использован ау-топсийный материал легких от пациентов, умерших с признаками прогрессирующей легочной дисфункции и явлениями острого респираторного дистресс-синдрома, не имевших диагноза “грипп”, Результаты и обсуждение Изучение репродукции вируса гриппа в культуре клеток EAhy926. Как видно из таблицы, исследуемые вирусы были способны инфицировать клеточную культуру EAhy926. Однако инфекционный титр вируса в клетках эндотелия и титр в РГА был ниже, чем в культуре клеток MDCK, которая является пермиссивной культурой для вируса гриппа. Возможно, это объясняется особенностями физиологии эндотелиальных клеток. Наши данные совпадают с данными H. Klenk [9], A. Feldmann и соавт. [8], M. Chan и соавт. [7], показавших способность вируса чумы птиц и вирусов гриппа H5N1 и H1N1, выделенных в 1997-1998 гг., репродуцироваться в клетках эндотелия куриных эмбрионов и первичной культуре клеток эндотелия легких. Электронно-микроскопический анализ морфологии эндотелиальной клеточной культуры EAhy926. Как видно из рис. 1, б, в, г, в клетках, инфицированных исследуемыми вирусами, отмечено увеличение количества диктиосом и расширение цистерн аппарата Гольджи, а также увеличение количества шероховатого эндоплазматического ретикулума. Кроме этого, в инфицированных клетках наблюдали увеличение количества миелоидных телец и обнаруживали вакуоли с вирусоподобными частицами. Все это указывает на наличие в исследуемых клетках вирусной инфекции. Иммуногистохимический анализ аутопсийного материала из легких пациентов, умерших во время эпидемии 2009-2010 гг. Для подтверждения возможности репродукции вируса гриппа в эндотелии был проведен иммуногистохимический анализ аутоп-сийного материала легких 8 пациентов, умерших во время эпидемии 2009-2010 гг. Как видно на рис. 2, в, НА вируса гриппа H1N1v локализовался на плазматической мембране и в цитоплазме клеток эндотелия мелких кровеносных сосудов, клеток альвеолярного и бронхиолярного эпителия и внутри альвеолярных и тканевых макрофагов. NP-антиген этого вируса (см. рис. 2, г) регистрировали в тех же клетках и тканях, что и НА, но NP был локализован в ядрах клеток, что отражает особенности репродукции вируса гриппа. Все описанные выше этапы исследования показали, что вирус гриппа может полноценно репродуцироваться в эндотелии кровеносных сосудов и вызывать повреждение его клеток. С нашей точки зрения эти результаты исследования репродукции вирусов гриппа типа А (подтипы H3N2, H5N1, H1N1v 2009 г. выделения) представляются чрезвычайно важными для изучения патогенеза гриппозной инфекции и разработки новых подходов к лечению гриппа и созданию этиотропных комплексных противогриппозных препаратов.
×

Список литературы

  1. Богомолов Б. П., Молькова Т. Н., Девяткин А. В. Клиникоанатомические параллели поражения сердца при спорадическом гриппе // Клин. мед. - 2001. - № 9. - С. 50-53.
  2. Парусов В. Н. Патологическая анатомия, патогенез и экспериментальная терапия тяжелых форм гриппа. - Л., 1981.
  3. Роганова И. В. Значение нарушений тромбоцитарно-сосудистого гемостаза в патогенезе гриппа // Инфекц. бол. - 2009. - Т. 7, прил. 1. - С. 183-184.
  4. Сергеев Н. В., Лейтес Ф. Я. Поражения сердечно-сосудистой си стемы при гриппе. - М., 1962.
  5. Цинзерлинг А. В. Этиология и патологическая анатомия тяжелых форм ОРИ. - Л., 1977.
  6. Andreoletti L., Leveque N., Boulagnon C., Brasselet C. Viral causes of human myocarditis // Arch. Cardiovasc. Dis. - 2009. - Vol. 102. -P. 6-7.
  7. Chan Michael C. W., Chan Rehee W. Y., Yu W. C. L. et al. Influenza H5N1 virus infection of polarized human epithelial cells and lung microvascular endothelial cells // Respir. Res. - 2009. - Vol. 10, N1. - P. 102-115.
  8. Feldmann A., Schafer M. K., Garten W., Klenk H. D. Targeted infection of endothelial cells by avian influenza virus A/FPV/ Rostock/34(H7N1) in chicken embryos // J. Virol. - 2000. - Vol. 74, N 17. - P. 8018-8027.
  9. Klenk H. D. Infection of endothelium by influenza viruses // Thromb. Haemost. - 2005. - Vol. 94, N 2. - P. 262-265.
  10. Mohammad Madjid. Acute infections, vaccination and prevention of cardiovascular disease // Can. Med. Assoc. J. - 2008. - Vol. 179, N8. - P. 749-750.
  11. Smeeth L., Thomas S. L., Hall A. J. et al. Risk of myocardial dial infarction and stroke after acute infection or vaccination // N. Engl. J. Med. - 2004. - Vol. 351. - P. 2611-2618.
  12. Soto-Abraham M. V., Soriano-Rosas J., Diaz-Quinonez A. et al. Pathological changes associated with the 2009 H1N1 virus // N. Engl. J. Med. - 2009. - Vol. 361. - P. 2001-2003.

Дополнительные файлы

Доп. файлы
Действие
1. JATS XML

© Жилинская И.Н., Азаренок А.А., Ильинская Е.В., Прочуханова А.Р., Воробьев С.Л., Сорокин Е.В., Царева Т.Р., 2012

Creative Commons License
Эта статья доступна по лицензии Creative Commons Attribution 4.0 International License.

СМИ зарегистрировано Федеральной службой по надзору в сфере связи, информационных технологий и массовых коммуникаций (Роскомнадзор).
Регистрационный номер и дата принятия решения о регистрации СМИ: серия ПИ № ФС77-77676 от 29.01.2020.


Данный сайт использует cookie-файлы

Продолжая использовать наш сайт, вы даете согласие на обработку файлов cookie, которые обеспечивают правильную работу сайта.

О куки-файлах