Молекулярно-эпидемиологический анализ геновариантов SARS-CoV-2 на территории Москвы и Московской области

Полный текст

Введение

Благодаря беспрецедентным усилиям учёных, врачей и работников клинико-диагностических лабораторий по секвенированию генома SARS-CoV-2 появилась возможность наиболее полно отслеживать и анализировать появляющиеся новые варианты SARS-CoV-2 с отличающимся эпидемиологическим поведением. В настоящее время в общедоступной базе данных GISAID (Global Initiative on Sharing Avian Influenza Data) содержится более 12 млн полных геномов SARS-CoV-2, и данный факт является первым случаем такого масштабного секвенирования за всю историю циркулирования вирусов в мире [1]. В условиях продолжающейся пандемии и адаптивной эволюции вируса [2] данная информация является крайне важной и служит предиктором новых вариантов SARS-CoV-2, которые имеют более выраженные эпидемиологические, иммунологические или патогенные свойства [3].

Ввиду зависимости распространения вирусных вариантов от таких факторов, как случайность, свойства вируса и хозяина, а также социальных факторов и мер здравоохранения предсказать распределение генетических линий в том или ином географическом регионе практически невозможно. Тем более, как подчеркивают авторы некоторых исследований, зачастую это распределение не зависит от приспособленности отдельных геновариантов, а обусловлено эпидемиологическими факторами [4–6].

Анализ проявлений эпидемического процесса COVID-19 и циркуляции геновариантов SARS-CoV-2 на территории РФ за 2020–2022 гг. позволил выделить два этапа и пять подъёмов заболеваемости COVID-19, каждый из которых имел свои особенности. Первый этап (март – декабрь 2020 г.) был обусловлен появлением нового возбудителя в популяции человека, который под воздействием социальных и природных факторов дал начало дальнейшему развитию эпидемического процесса COVID-19. На втором этапе пандемии COVID-19 на территории РФ (с декабря 2020 г. по настоящее время) произошли изменения биологических свойств вируса SARS-CoV-2 с последующей сменой превалирующих геновариантов [7].

В начале 2020 г. разнообразие SARS-CoV-2 на территории России ограничивалось несколькими генетическими линиями, из которых доминировала линия B.1, появившаяся в Северной Италии и достигавшая своего пика в 62% в марте – мае 2020 г., и линия B.1.1, циркулировавшая вплоть до февраля 2021 г. и достигавшая своего пика в 82% в июле – августе 2020 г. [8]. По данным GISAID, скорость появления новых линий возросла во время второй волны пандемии, начавшейся в России в сентябре 2020 г. [9]. Так, согласно Всемирной организации здравоохранения, в мире появились варианты, вызывающие озабоченность (variant of concern – VOC), которые были названы альфа (линия B.1.1.7), бета (B.1.351), гамма (P.1), дельта (B.1.617.2) и омикрон (B.1.1.529) [10]. Все перечисленные линии обладали повышенной трансмиссивностью благодаря мутациям в RBD-связывающем домене спайкового белка, а также пониженной чувствительностью к нейтрализации моноклональными антителами, сывороткам выздоравливающих и иммунизированных людей, а также вакцинам [11].

Несмотря на постоянный мониторинг циркулирующих геновариантов в мире и огромный вклад всех стран по созданию новых терапевтических противовирусных средств, моноклональных антител и вакцин, SARS-CoV-2 продолжает эволюционировать и производить новые VOC, а в его геноме появляются всё новые значимые мутации. Соответственно, исследования по изучению распространения вируса в разных странах и регионах, в том числе для совершенствования и разработки новых препаратов для профилактики COVID-19, является актуальной задачей.

Целью данной работы было оценить распространение различных вариантов SARS-CoV-2 на территории Москвы и Московской области.

Материалы и методы

Составление набора данных последовательностей

В исследовании было использовано 227 последовательностей SARS-CoV-2, 31 из которых была получена при взятии назофарингеальных мазков у пациентов с симптомами новой коронавирусной инфекции из Инфекционной клинической больницы (ИКБ) № 1 г. Москвы в период с марта 2021 г. по апрель 2022 г., а 196 образцов были получены из общедоступной базы данных GISAID [1].

Исследование проводилось при добровольном информированном согласии пациентов. Протокол исследования одобрен Этическим комитетом ФГБУ «Национальный исследовательский центр эпидемиологии и микробиологии имени почетного академика Н.Ф. Гамалеи» Минздрава России (протокол № 32 от 01.12.2022).

Выделение вируса SARS-CoV-2 в культуре клеток Vero E6

В работе использовали перевиваемую линию клеток почки африканской зелёной мартышки (Chlorocebus aethiops) Vero Е6, предоставленную Всероссийской коллекцией клеточных культур ФГБУ «Национальный исследовательский центр эпидемиологии и микробиологии имени почётного академика Н.Ф. Гамалеи» Минздрава России.

Выращивание клеток осуществляли на среде DMEM (Dulbecco’s modified Eagles medium) с 5% эмбриональной телячьей сывороткой (ЭТС). В 96-луночные культуральные плоскодонные планшеты помещали клетки Vero E6 по 12 000 кл/лунка в объёме 100 мкл свежеприготовленной среды. Культивировали 24 ч при температуре 37 °C в атмосфере 5% CO₂ до образования монослоя клеток.

Перед внесением проб из планшетов удаляли ростовую среду, промывали клетки 1–2 раза бессывороточной средой и вносили поддерживающую среду (DMEM с 1% ЭТС).

Пробы носоглоточных мазков от пациентов с клиническим диагнозом «новая коронавирусная инфекция» обследовали на наличие вируса методом выделения в культуре клеток Vero Е6. С палочки тампона делали смыв поддерживающей средой и вносили жидкость в лунки планшета с монослоем клеток. Планшеты инкубировали при температуре 37 °C в атмосфере 5% CO₂ в течение 96 ч.

Для обнаружения изменения состояния клеточного монослоя (развитие цитопатического действия (ЦПД) вируса) просматривали лунки планшета в инвертированном микроскопе каждые 24 ч. При обнаружении ЦПД культуральную жидкость переносили в новую лунку с монослоем (пассировали). После выявления ЦПД в пассажных клетках культуральную жидкость отбирали и исследовали методом полимеразной цепной реакции (ПЦР) для обнаружения рибонуклеиновой кислоты (РНК) вируса SARS-CoV-2. Положительные образцы секвенировали и регистрировали в международной базе данных GISAID.

Выделение РНК SARS-CoV-2

Выделение РНК проводили путём экстракции из суспензии исследуемых образцов (культуральной жидкости) смесью гуанидина изотиоцианата, фенола и хлороформа [12].

Проведение обратной транскрипции и полимеразной цепной реакции

Для получения амплифицированных фрагментов использовали набор OneTube RT-PCR («Евроген», Россия) согласно рекомендациям производителя. Обратную транскрипцию (ОТ) и ПЦР проводили в тонкостенных пробирках объёмом 0,2 и 0,5 мл (QSP) на амплификаторах Mastercycler Gradient (Eppendorf, Германия) или «Терцик» («ДНК-технология», Россия). Общий объём реакционной смеси составлял 20 мкл. В реакционную смесь входили следующие компоненты: 10 мкл ОТ-ПЦР mix, по 5 пМ прямого и обратного праймера, 3 мкл раствора РНК и 1 мкл смеси ферментов. Амплификацию ОТ-ПЦР осуществляли с использованием следующих параметров: 42 °C 40 мин, 85 °C 2 мин (94 °C 15 с, 50 °C 15 с, 72 °C 90 с) 35 циклов; 72 °C 5 мин 1 цикл.

Секвенирование

Первичную нуклеотидную последовательность определяли по методу Сэнгера при помощи прямого секвенирования ПЦР-продукта с использованием BigDye Terminator v3.1 Cycle Sequencing Kit (Applied Biosystems, США) согласно рекомендациям изготовителя. Электрофорез ДНК осуществлялся на автоматическом ДНК-анализаторе ABI Prism 3130xl (Applied Biosystems, США).

Компьютерный анализ нуклеотидных последовательностей

Компьютерный анализ нуклеотидных последовательностей проводили с помощью пакетов программ DNASTAR (Lasergene v.6). Подбор праймеров для проведения реакций ОТ, ПЦР и секвенирования выполняли с помощью программы Primer Premier 5.00 (PREMIER Biosoft International, США). В работе были использованы синтетические олигонуклеотиды производства фирмы «Литех» (Россия).

Клинико-эпидемиологические данные

Эпидемиологические метаданные, такие как возраст, пол, район отбора проб, а также клиническая и вирусологическая информация были доступны для 31 последовательности и использовались в качестве данных о признаках. В силу плохого качества нуклеотидной последовательности одного образца было задепонировано в общедоступную базу GISAID 30 последовательностей. Номера доступа GISAID для последовательностей, используемых в этом исследовании: EPI_ISL_14995632, EPI_ISL_14988081, EPI_ISL_14988080, EPI_ISL_14988061, EPI_ISL_14988083, EPI_ISL_14988060, EPI_ISL_14988082, EPI_ISL_14988063, EPI_ISL_14988085, EPI_ISL_14988062, EPI_ISL_14988084, EPI_ISL_14988065, EPI_ISL_14988064, EPI_ISL_14988067, EPI_ISL_14988066, EPI_ISL_14988069, EPI_ISL_14988068, EPI_ISL_14988070, EPI_ISL_14988072, EPI_ISL_14988071, EPI_ISL_14988074, EPI_ISL_14988073, EPI_ISL_14988076, EPI_ISL_14988075, EPI_ISL_14988078, EPI_ISL_14988077, EPI_ISL_14988058, EPI_ISL_14988057, EPI_ISL_14988079, EPI_ISL_14988059.

Выравнивание последовательностей и филогенетический анализ

В результате выравнивания последовательностей один образец был удалён в силу плохого качества сиквенса. Нуклеотидные последовательности 30 московских образцов и 196 образцов из GISAID выравнивали с помощью MAFFT [13]. Исходное предковое дерево было создано с помощью филогенетического анализа с использованием метода максимального правдоподобия (ML) в IQ-TREE v1.6.12 [14] по модели нуклеотидных замен GTR, которая была выбрана как наиболее подходящая в jModelTest 2.1.7 [15]. Для проверки геноварианта методом ML к выравненным московским последовательностям из ИКБ № 1 были добавлены эталонные последовательности геновариантов и их сублиний, которые были взяты из базы данных последовательностей SARS-CoV-2 GISAID. Полученное филогенетическое дерево было подтверждено с использованием локального экземпляра рабочего процесса Nextstrain [16], который использует анализ ML, реализованный в Tree-Time [16, 17]. Общий набор данных для анализа Nextstrain ML содержал 226 последовательностей SARS-CoV-2: 30 последовательностей S-, E-, M-, N-белков вируса из Москвы, 196 полных геномов глобальных последовательностей SARS-CoV-2, которые использовались в качестве внешней группы. Визуализация дерева была проведена с помощью Auspice версии 2.34.1 [18]. Корнем дерева считался образец hCoV-19/Wuhan/WIV04/2019 (WIV04), который обозначается в базе GISAID как EPI_ISL_402124.

Статистический анализ

Анализ эпидемиологических характеристик, таких как пол, возраст, компьютерная томография (КТ) при постановке, мазок при постановке, исход заболевания, был проанализирован с помощью критерия χ² Пирсона или двустороннего точного критерия Фишера (при необходимости). Различия считались достоверными при p менее 0,05. Все анализы выполнены в программе Statistica 10.0 (StatSoft, США).

Клинико-эпидемиологическая характеристика исследуемых образцов

Отобраны пробы от 31 пациента, госпитализированного в ИКБ № 1 в период с марта 2021 г. по апрель 2022 г. (табл. 1). Из них 30 пациентов проживали на территории 8 из 12 административных округов (АО) Москвы (Зеленоградский АО – 4, Южный – 2, Юго-Западный – 3, Центральный – 1, Северо-Западный – 9, Северо-Восточный – 4, Северный – 3, Западный – 3, Восточный – 1), один – в г. Химки (Московская область). Два пациента были госпитализированы из одного эпидемического очага (мать с дочерью). Бо́льшая часть госпитализированных из Северо-Западного АО, по нашему мнению, связана с расположением инфекционного стационара в данном округе. За последние 2 недели 29 пациентов не выезжали за пределы региона проживания, одна пациентка выезжала из Москвы в Московскую область. Указания на предшествующий контакт с больным COVID-19 были у 7 заболевших.

 

Таблица 1. Клинико-эпидемиологические данные исследуемых образцов

Table 1. Clinical and epidemiological data of the studied samples

Показатель/Indicator	Значение/ Value, n (%)	p value
Средний возраст, лет / Average age, years, M ± m	57,5 ± 3,6
Пол/Gender Мужчины/Men Женщины/Women	17 (54,8) 14 (45,2)	0,27
КТ при постановке / CT at diagnosis 0 1 2 3 Не проведено / Not carried out	4 (12,9) 20 (64,5) 4 (12,9) 1 (3,2) 2 (6,5)	0,65 0,04 0,19 0,77
Мазок при постановке / Smear at diagnosis Положительный/Positive Отрицательный/Negative	27 (87,1) 4 (12,9)	0,018
Исход заболевания / Outcome of the disease Выписан/Discharged Умер/Died	30 (96,8) 1 (3,2)	8,32
Заключительный диагноз / Final diagnosis COVID-19, вирус идентифицирован / Virus identified COVID-19, вирус не идентифицирован / Virus not identified	28 (90,3) 3 (9,7)	0,007

 

Возраст пациентов составил от 24 до 99 лет, в среднем 57,5 ± 3,6 года. В группе было 14 женщин (45,2%). Хронические заболевания установлены у 19 (61,2%) пациентов, сочетанная коморбидная патология (более одного хронического заболевания) выявлена у 12 человек. Пациенты были госпитализированы на 3–8-й день от начала заболевания, медиана – 6-й [4; 8] день болезни. Противовирусную терапию до госпитализации получали 14 человек (умифенавир, фавипиравир, триазаверин).

Изменения в лёгких при мультиспиральной КТ (МСКТ) грудной клетки были установлены у 25 человек (до 25% поражения лёгких – 20, 25–50% – 4, 50–75% – 1). Двум пациентам МСКТ не была проведена.

Тридцать пациентов были выписаны с улучшением на амбулаторное лечение, один мужчина 50 лет скончался на 23-й день болезни (15-й день стационарного лечения) на фоне прогрессирующей дыхательной, сердечно-сосудистой недостаточности. Количество койко-дней составило от 2 до 26, медиана 8 [6; 12].

Филогенетический анализ исследуемых образцов

Филогенетическая дендрограмма с использованием метода ML была построена с использованием 196 полных геномов, взятых в открытой базе данных GISAID, включающих референс-штаммы Nextstrain для каждого варианта, а также 31 образец белков вируса S, E, M, N, полученных в лаборатории. Один образец был удалён в силу низкого качества сиквенса. Филогенетический анализ 30 образцов белков S (рецептор-связывающий белок), E (оболочечный белок), M (мембранный белок), N (нуклеокапсидный белок) SARS-CoV-2, полученных в лаборатории, позволил определить 4 клада московских образцов SARS-CoV-2 с высокой статистической поддержкой (PP ≈ 1,0 во всех случаях). В результате субтипирования московских образцов, полученных из ИКБ № 1, удалось выявить наиболее часто циркулирующие варианты и VOC в России и в мире, а именно: альфа (GRY; B.1.1.7 + Q.*), впервые выявленный на территории Великобритании дельта (GK; B.1.617.2 + AY.*), впервые детектированный в Индии, и омикрон (GRA; B.1.1.529 + BA.*), впервые обнаруженный в Ботсване, Гонконге и Южной Африке (рис. 1).

 

Рис. 1. Общая дендрограмма максимального правдоподобия 30 московских последовательностей, полученных из Инфекционной клинической больницы № 1, с 196 общедоступными последовательностями из открытой базы данных GISAID (использовались референс-варианты Nextstrain). Дерево укоренено с помощью референс-образца из Уханя (hCoV-19/Wuhan/WIV04/2019 (WIV04)). Цветом и подписями обозначены варианты, вызывающие озабоченность и интерес (VOC и VOI).

Fig. 1. Maximum likelihood dendrogram for 30 Moscow sequences obtained from Infectious Clinical Hospital No. 1 together with 196 available sequences from the GISAID database (Nextstrain reference variants were used). The tree is rooted using a reference sample from Wuhan (hCoV-19/Wuhan/WIV04/2019 (WIV04)). Variants of concern and interest (VOC and VOI) are marked with color and captions.

 

В то же время перечисленные VOC являются наиболее интересными вариантами с точки зрения создания вакцин. В результате филогенетического анализа методом ML 10 (33,3%) образцов из ИКБ № 1 были отнесены к линии B.1.1 вместе с референс-штаммами из Японии, США и России (рис. 2). В свою очередь, 8 из 9 образцов образовывали между собой высокоподдерживаемый кластер (PP = 1,0) (рис. 2). Высокая бутстрэп-поддержка (PP = 1) наблюдалась в кладе B.1.1.7 (альфа). В данной кладе группировались вместе 9 (30,0%) образцов из ИКБ № 1 и референс-штаммы из Германии, США и Швеции. Пять московских образцов (n = 31; 16,7%), полученные из ИКБ № 1, и референс-штаммы из Англии, Шотландии, США, Швейцарии, Германии и Сингапура вместе образовывали кладу и относились к варианту AY.122 (B.1.617.2, дельта) (PP = 1,0) (рис. 2). В то же время образец 252 объединялся в единый клайд с высокой статистической поддержкой (PP = 1,0) с референс-образцами из Англии, Шотландии и США. И, наконец, 6 (20,0%) московских образцов были отнесены к варианту BA.1.1 (B.1.1.529, омикрон) вместе с референс-штаммами из Люксембурга, США и Италии (рис. 2).

 

Рис. 2. Дендрограммы максимального правдоподобия московских образцов. Жирными точками указаны Московские образцы из ИКБ № 1. Цифрами у узлов деревья указаны высокоподдерживаемые ветви (бутстрэп поддержка > 0,9). Названия образцов указаны в соответствии с названиями из базы данных GISAID: а – линия B.1.1 вместе с референс-штаммами из Японии, США и России, б – линия B.1.1.7 (Alpha) с референс-штаммами из Германии, США и Швеции, в – линия BA.1.1 (B.1.1.529; Omicron) вместе с референс-штаммами из Люксембурга, США и Италии, г – линия AY.122 (B.1.617.2; Delta) с референс-штаммами из Англии, Шотландии, США, Швейцарии, Германии и Сингапура.

Fig. 2. Maximum likelihood dendrograms of Moscow samples. Illuminated dots indicate Moscow samples from IKH№1. The numbers at the tree nodes indicate highly supported branches (bootstrap support > 0.9). The names of the specimens are given according to the names from the GISAID database: a – line B.1.1 together with reference strains from Japan, USA and Russia, b – line B.1.1.7 (Alpha) with reference strains from Germany, USA and Sweden, c – line BA.1.1 (B.1.1.529; Omicron) together with reference strains from Luxembourg, USA and Italy, d – line AY.122 (B.1.617 .2; Delta) with reference strains from England, Scotland, USA, Switzerland, Germany and Singapore.

 

Анализ наиболее часто встречающихся мутаций в структурных белках SARS-CoV-2

При исследовании московских образцов (n = 30), полученных из ИКБ № 1, на наличие мутаций в структурных белках SARS-CoV-2 разных генетических вариантов зафиксирована значительная доля встречающихся вариантов замен, таких как S-белок – D614G (26/30; 86,7%), P681H/R (19/30; 63,3%), H69del + V70del (15/30; 50,0%), Y144del (14/30, 46,7%), N501Y (13/30, 43,3%), E156del + F157del + R158del/G (12/30, 40%), E484K (9/30, 30,0%); E-белок – T9I (6/30; 20,0%); M-белок – I82T (9/30; 30,0%), D3G (6/30; 20,0%), Q19E (6/30; 20,0%), A63T (6/30; 20,0%) и, наконец, N-белок – R203K/M (27/30; 90,0%), G204R/P (22/30; 73,3%), D3L (7/30; 23,3%), S235F (7/30; 23,3%) (табл. 2).

 

Таблица 2. Частота встречаемости мутаций в белках S, E, M, N SARS-CoV-2, n (%)

Table 2. Frequency of mutations in S, E, M, N SARS-CoV-2 proteins, n (%)

Тип мутации / Mutation type	Частота встречаемости мутации / Mutation frequency
Мутации в белке S / Mutations in protein S
H69del + V70del	15 (50,0)
Y144del	14 (46,7)
E156del + F157del + R158del/G	12 (40,0)
E484K	9 (30,0)
N501Y	13 (43,3)
A570D	9 (30,0)
D614G	26 (86,7)
P681H/R	19 (63,3)
T716I	8 (26,7)
Мутации в белке E / Mutations in protein E
T9I	6 (20,0)
Мутации в белке M / Mutations in protein M
I82T	9 (30,0)
D3G	6 (20,0)
Q19E	6 (20,0)
A63T	6 (20,0)
Мутации в белке N / Mutations in protein N
D3L	7 (23,3)
R203K/M	27 (90,0)
G204R/P	22 (73,3)
S235F	7 (23,3)

 

На рис. 3 изображена частота мутаций в структурных белках, самым вариабельным участком является нуклеотидная последовательность гена S, именно в данном участке встречалось большее разнообразие мутаций. Мутации N501Y, E484K, D614G и P681H/R являются примерами общих мутаций между вариантами B.1.1.7, B.1.351, P.1, B.1.617.2 и B.1.1.529.

 

Рис. 3. Частота мутаций в структурных белках SARS-CoV-2 (S, E, M, N) московских образцов из Инфекционной клинической больницы № 1.

Fig. 3. Frequency of mutations in SARS-CoV-2 structural proteins (S, E, M, N) in Moscow samples from Infectious Clinical Hospital No. 1.

 

Согласно рис. 3 самым высококонсервативным структурным белком SARS-CoV-2 оказался белок оболочки вируса (E), на его участке была найдена только одна мутация – T9I, которая встретилась только у образцов, относящихся к варианту B.1.1.529 (омикрон), и, согласно исследованию [19], имела самую высокую распространённость среди всех мутаций в оболочечном белке.

Анализируя частоту встречаемости мутаций в гене мембраны (M), можно сказать, что в нашем исследовании данный белок оставался высококонсервативным, но в настоящее время имеются данные о быстром увеличении мутаций в данном белке за счёт замены I82T, которая была самой распространённой и в нашем исследовании [20].

Вторым по вариабельности геном после S-белка стал белок N, отвечающий за формирование новых вирусных частиц. Самыми распространёнными мутациями в данном белке оказались замены R203K/M и G204R/P, часто данные мутации были сопряжены друг с другом. Недавние исследования показали, что частота данных мутаций в белке нуклеокапсида (N) SARS-CoV-2 увеличивается среди новых вариантов, вызывающих озабоченность или интерес.

Результаты и обсуждение

В начале пандемии COVID-19 Россия оказалась несколько изолированной ввиду того, что были применены строгие эпидемиологические меры против распространения SARS-CoV-2, поэтому первые случаи COVID-19, а также случаи появления VOC произошли здесь позже, чем во многих других странах мира [21]. Тем не менее, несмотря на закрытие границ, импорт новых геновариантов продолжался, также происходили изменения биологических свойств вируса в виде накапливания ключевых мутаций, напрямую или косвенно влияющих на контагиозность, патогенность и реакцию на иммунизацию. Это привело к появлению тысячи российских линий, а также VOC [21, 22].

Так, во время второй волны пандемии (сентябрь 2020 г.) в России появилась линия B.1.1.7 (20I (альфа, V1)), которая уже в марте 2021 г. достигла частоты более 15% [22]. Вместе с вариантом B.1.1.7 в апреле 2021 г. в России были уже широко распространены российские линии B.1.1.524 и B.1.1.52. В середине весны 2021 г. ввиду одного случая завоза или нескольких в одно и то же время из одного плохо отобранного географического места в России появился вариант дельта (B.1.617.2; AY.122), частота которого увеличилась с 1% в апреле до более чем 90% в июне [23]. В конце 2021 г. был обнаружен новый VOC – B.1.1.529 (омикрон), который почти сразу вытеснил предыдущий доминирующий во всём мире вариант дельта (B.1.617.2), и в настоящее время он является преобладающим. Вакцины и терапевтические средства являются очень ценными инструментами в борьбе с SARS-CoV-2 и прогрессированием заболевания. Однако некоторые мутации вируса могут вызывать изменения ряда свойств, таких как инфекционная активность, патогенность, в том числе ускользание от современных терапевтических моноклональных антител и существующих вакцин [24, 25].

В настоящем исследовании мы провели молекулярно-эпидемиологический анализ геновариантов SARS-CoV-2, полученных в ИКБ № 1 (г. Москва). В результате филогенетического анализа мы выявили основные циркулирующие в России VOC на протяжении всего времени существования пандемии, а именно: вариант B.1.1.7 (альфа), который составил 30% (9/30) от общей выборки, исследуемых пациентов (n = 30), AY.122 (B.1.617.2, дельта), составивший 16,7% (5/30), BA.1.1 (BB.1.1.529, омикрон), составивший 20% (6/30) и B.1.1, составивший 33,3% (10/30). Следует отметить, что анализ проводился начиная с конца 2020 г., когда доминирующим вариантом в России был B.1.1, по весну 2022 г., когда доминирующим вариантом стал BA.1.1 (омикрон). Поэтому данное исследование отражает распространённость каждого варианта по генеральной совокупности последовательностей разных штаммов коронавируса.

Анализ мутаций в структурных белках S, E, M, N SARS-CoV-2 показал, что разнообразие мутаций в большей степени приходится на S-белок, а именно на часть RBD и других доменов. Данный факт очевиден с точки зрения того, что для эффективной адаптации коронавируса к новому хозяину необходимы мутации, влияющие на связывание с рецептором, поэтому данный белок играет важную роль в патогенезе вирусной инфекции и является критическим детерминантом вирусного тропизма и инфекционности [26].

Самой распространённой мутацией в S-белке различных генетических вариантов SARS-CoV-2 была замена D614G, которая отмечалась повышенной контагиозностью (в 4–9 раз), но не являлась мутацией, ускользающей от иммунного ответа [27]. Вторая по частоте встречаемости была замена P681H/R, которая потенциально могла бы влиять на усиление инфекции и трансмиссивность, однако исследования продолжаются [28, 29]. Следующей по распространённости и значимости была мутация E484K/A, которая вызывает особую озабоченность ввиду того, что она повышает аффинность к рецептору hACE2 (человеческий ангиотензинпревращающий фермент 2) и может ускользать от моноклональных антител, а также сывороток выздоравливающих/вакцинированных. Часто встречающаяся в данном исследовании замена N501Y, помимо влияния на аффинность к hACE2-рецептору, ускользание от моноклональных антител, а также сывороток выздоравливающих/вакцинированных, повышает трансмиссивность вируса и влияет на течение заболевания [30–33].

Самой распространённой в белке M была мутация I82T (9/30; 30%). Учитывая её быстрое появление в ряде стран и роль белка М во многих вирусных функциях, включая связывание вирусных клеток-хозяев, врождённый иммунный и Т-клеточный ответ при SARS и SARS-CoV-2 с возможным уклонением от иммунитета, данная мутация требует включения в текущий геномный надзор за SARS-CoV-2 и дальнейшую оценку потенциального увеличения географического распространения и патогенности.

Белок N был вторым по разнообразию и количеству присутствующих мутаций после белка S и представлен в основном мутациями R203K/M и G204R/P. В исследовании [34] было показано, что R203K/G204R связаны с появлением высококонтагиозной линии SARS-CoV-2 B.1.1.7. Конкурентные эксперименты предполагают, что варианты 203K/204R обладают преимуществом репликации по сравнению с предшествующими вариантами R203/G204, возможно, связанными со сборкой рибонуклеокапсида (RNP). Более того, вирус 203K/204R проявляет повышенную инфекционность в клетках лёгких человека и хомяков.

Наконец, наши результаты ограничены областью генов S, E, M, N SARS-CoV-2. Использование полных геномов может обеспечить более точный вывод результатов исследования, что следует учитывать при интерпретации результатов настоящего исследования.

Заключение

В настоящем исследовании мы выявили основные мутации и варианты вируса SARS-CoV-2, которые были получены из ИКБ № 1 и циркулировали на территории Москвы и Московской области в период с марта 2020 г. по апрель 2022 г. В свою очередь, изучение частоты и влияния мутаций, а также анализ наиболее часто циркулирующих вариантов вируса важны для разработки и совершенствования вакцин для профилактики COVID-19. Можно предположить, что оптимизация антигенного состава вакцин в соответствии с упомянутыми выше мутациями, которые соответствуют разным вариантам вируса, обеспечит синтез специфических антител. Тем не менее предстоящая задача остаётся огромной: уровни передачи высоки даже в районах с широко распространённой вакцинацией и предыдущими волнами инфекции, в геноме SARS-CoV-2 появляются новые мутации, и остаётся много открытых вопросов о будущем эпидемиологическом воздействии данного вируса. Следовательно, эпидемиологические исследования, особенно направленные на изучение генома SARS-CoV-2 молекулярными методами, должны продолжаться и составлять неотъемлемую часть в разработке вирусных вакцин для профилактики COVID-19.

Участие авторов: Ожмегова Е.Н. – написание статьи, выделение РНК вируса, амплификация и секвенирование, филогенетический анализ; Савочкина Т.E. – написание статьи, выделение РНК SARS-CoV-2, амплификация и секвенирование; Прилипов А.Г. – выделение РНК SARS-CoV-2, амплификация и секвенирование, анализ сиквенсов; Тихомиров Е.Е. – выделение РНК SARS-CoV-2, амплификация и секвенирование; Сайфуллин М.А. – написание статьи, отбор проб от пациентов; Ларичев В.Ф. – выделение SARS-CoV-2 в культуре клеток; Гребенникова Т.В. – организация исследования, анализ полученных результатов, редактирование текста.

Финансирование. Государственное задание Минздрава России «Разработка прототипа вакцины на основе VLP для профилактики COVID-19».

Конфликт интересов. Авторы заявляют об отсутствии конфликта интересов.

Этическое утверждение. Исследование проводилось при добровольном информированном согласии пациентов. Протокол исследования одобрен Этическим комитетом ФГБУ «Национальный исследовательский центр эпидемиологии и микробиологии имени почетного академика Н.Ф. Гамалеи» Минздрава России (протокол № 32 от 01.12.2022).

Об авторах

Екатерина Никитична Ожмегова

ФГБУ «Национальный исследовательский центр эпидемиологии и микробиологии имени почётного академика Н.Ф. Гамалеи» Минздрава России

Email: ozhmegova.eka@gmail.com
ORCID iD: 0000-0002-3110-0843

научный сотрудник лаборатории вирусов лейкозов

Россия, 123098, Москва

Татьяна Евгениевна Савочкина

ФГБУ «Национальный исследовательский центр эпидемиологии и микробиологии имени почётного академика Н.Ф. Гамалеи» Минздрава России

Email: tasavochkina@yandex.ru
ORCID iD: 0000-0003-4366-8476

младший научный сотрудник лаборатории молекулярной диагностики

Россия, 123098, Москва

Алексей Геннадьевич Прилипов

ФГБУ «Национальный исследовательский центр эпидемиологии и микробиологии имени почётного академика Н.Ф. Гамалеи» Минздрава России

Email: a_prilipov@mail.ru
ORCID iD: 0000-0001-8755-1419

доктор биологических наук, зав. лабораторией молекулярной генетики

Россия, 123098, Москва

Е. Е. Тихомиров

ФГБУ «Национальный исследовательский центр эпидемиологии и микробиологии имени почётного академика Н.Ф. Гамалеи» Минздрава России

Email: ozhmegova.eka@gmail.com
Россия, 123098, Москва

Виктор Филиппович Ларичев

ФГБУ «Национальный исследовательский центр эпидемиологии и микробиологии имени почётного академика Н.Ф. Гамалеи» Минздрава России

Email: vlaritchev@mail.ru
ORCID iD: 0000-0001-8262-5650

д.м.н., ведущий научный сотрудник лаборатории биологии и индикации арбовирусов

Россия, 123098, Москва

Мухаммад Абдулфаритович Сайфуллин

ФГБУ «Национальный исследовательский центр эпидемиологии и микробиологии имени почётного академика Н.Ф. Гамалеи» Минздрава России; ФГАОУ ВО «Российский национальный исследовательский медицинский университет имени Н.И. Пирогова» Минздрава России

Email: dr_saifullin@mail.ru
ORCID iD: 0000-0003-1058-3193

к.м.н., доцент кафедры инфекционных болезней у детей педиатрического факультета, с.н.с. лаборатории биологии и индикации арбовирусных инфекций 

Россия, 123098, Москва; 117997, Москва

Татьяна Владимировна Гребенникова

ФГБУ «Национальный исследовательский центр эпидемиологии и микробиологии имени почётного академика Н.Ф. Гамалеи» Минздрава России

Автор, ответственный за переписку.
Email: t_grebennikova@mail.ru
ORCID iD: 0000-0002-6141-9361

доктор биологических наук, профессор, чл.-корр. РАН, зав. лабораторией молекулярной диагностики, зав. отделом

Россия, 123098, Москва

Список литературы

Дополнительные файлы