Циркуляция вирусов герпеса крупного рогатого скота (Herpesviridae: Varicellovirus) и диареи крупного рогатого скота (Flaviviridae: Pestivirus среди диких парнокопытных животных Московской области

Полный текст

Введение

В течение двух последних десятилетий в мировой научной литературе прослеживается повышенный интерес к изучению распространения возбудителей инфекционных болезней крупного рогатого скота (КРС) в популяции диких парнокопытных животных. Особый интерес исследователей вызывают вирусы герпеса КРС 1-го типа (BoHV-1) и диареи КРС (BVDV) как возбудители инфекционного ринотрахеита (ИРТ) КРС и вирусной диареи (ВД) КРС – болезней, строго контролируемых Всемирной организацией здоровья животных (МЭБ).

В 2007 г. исследования популяции аляскинского карибу показали серопревалентность животных к BoHV-1 на уровне 47% [1]. Исследования материала от яков, обитающих в Цинхай-Тибетском нагорье Китая, проведённые в 2011–2012 гг., показали, что антитела к BoHV-1 присутствуют у 27,9–44,6% яков из разных исследованных районов [2].

Исследования буйволов, проведённые в 2014 г. в Аргентине, позволили выделить несколько изолятов BoHV-1 [3]. Проведённое годом позже масштабное исследование диких копытных 59 лесных районов Польши показало, что антитела к BoHV-1 присутствуют у 54,2% животных. Наиболее часто антитела выявляли у благородных оленей (25,6%) и ланей (23,1%), а реже всего – у косуль (1,7%) [4].

Изучение муфлонов (Ovis orientalis), диких козлов (Capra aegagrus), индийских газелей (Gazella bennettii) и джейранов (Gazella subgutturosa), проведённое в 13 разных районов Ирана, показало отсутствие антител к BoHV-1, однако методом полимеразной цепной реакции (ПЦР) ДНК BoHV-1 была обнаружена в 1,5% случаев [5]. В более поздних исследованиях, проведённых на территории Ирана, от диких буйволов были выделены изоляты BoHV-1 [6].

Очень высокая серопревалентность диких жвачных к BoHV-1 была выявлена в Колумбии. Она составила 94,7% [7].

В Австралии учёные в 2009 г. постарались проследить связь серопревалентности интродуцированных диких оленей к BoHV-1 с интенсивностью домашнего животноводства в этом же районе. На основании результатов качественного анализа рисков авторы пришли к выводу, что вероятность инфицирования домашнего скота при прямом контакте с дикими парнокопытными жвачными животными является очень высокой [8]. Однако этот вывод требует дополнительных подтверждений.

Надо отметить, что значительный антигенный перекрёст не позволяет дифференцировать BoHV-1 от антигенно родственных α-герпесвирусов, которые могут встречаться у диких жвачных копытных [9–11]. Дело в том, что BoHV-1 входит в кластер близкородственных вирусов семейства Alphaherpesvirinae, включающий, помимо этого вируса и герпесвируса КРС 5-го типа (BoHV-5), ещё несколько вирусов жвачных парнокопытных, например, герпесвирус буйвола 1-го типа (BuHV-1), герпесвирус коз 1-го типа (CpHV-1), герпесвирус оленей 1-го типа (CvHV-1), герпесвирус оленей 2-го типа (CvHV-2) и герпесвирус лосей 1-го типа (ElkHV-1) [12]. Таким образом, антитела в организме диких животных могут вырабатываться в ответ на инфицирование любым вирусом рассматриваемой группы.

В отношении распространённости разных пестивирусов в популяциях диких жвачных копытных животных информации в научной литературе значительно меньше. Род Pestivirus, в который входит возбудитель ВД КРС, с 2018 г. решением Международного комитета по таксономии вирусов (ICTV) разделён на 11 видов, а ранее выделяемые BVDV 1, 2 и 3-го типа (BVDV-1, -2, -3), вирус классической чумы свиней (КЧС, CSFV) и вирус пограничной болезни (BDV) отнесены к отдельным видам: Pestivirus A (ранее – BVDV-1), Pestivirus B (BVDV-2), Pestivirus C (CSFV), Pestivirus D (BDV), Pestivirus H (BVDV-3, HoBi-like pestivirus) [13].

Несмотря на антигенное родство, описанное ещё в 1960-е гг. для BVDV и вируса КЧС [14], диапазон естественных хозяев вируса КЧС ограничивается домашними свиньями и дикими кабанами, в то время как BVDV-1 и BVDV-2 (Pestivirus A и В) и BDV способны проникать через межвидовые барьеры и заражать широкий круг парнокопытных [15].

Большинство исследователей диких парнокопытных животных изучают исключительно распространённость BVDV-1, и объём подобных исследований в популяциях в мире не менее значителен, чем в отношении BoHV-1. Ещё в 1983 г. L.G. Doyle и W.P. Heuschele опубликовали результаты исследования диких парнокопытных зоопарковых животных на наличие антител к вирусу BVDV. Серопревалентность животных, не вакцинированных против ВД КРС, составила 4,3% [16].

В более поздних исследованиях американским учёным удалось изолировать нецитопатический вирус против ВД КРС типа 1а из материала, отобранного от годовалой самки оленя-мула (Odocoileus hemionus) из северо-западного Вайоминга (США). Это второй описанный в литературе случай изоляции BVDV от свободно живущих оленей в Северной Америке и первый от оленя этого вида. Дополнительные серологические исследования, проведённые авторами в популяции Odocoileus hemionus, позволили установить, что общая серопревалентность к BVDV достигает 60% [17].

В 2008 г. исследователи, изучив в эксперименте восприимчивость к BVDV белохвостого оленя (Odocoileus virginianus), указали на необходимость корректировки программ борьбы с ВД КРС на территории США с учётом дальнейшего изучения эпизоотической ситуации по этой болезни в дикой фауне [18].

Ряд последующих исследований, проведённых европейскими учёными, позволил определить дополнительный круг диких парнокопытных животных, которые могут быть естественными резервуарами BVDV, а также установить возможность передачи возбудителя ВД от диких парнокопытных животных домашнему КРС и наоборот. В 2006 г. в Германии подтверждена возможность естественного заражения КРС от экспериментально инфицированного мышиного оленя (Tragulus javanicus) [19].

J. Casaubon и соавт. в 2012 г. впервые детектировали генетический материал BVDV у альпийской серны (Rupicapra rupicapra) в Швейцарии. По итогам проведённой работы авторы сделали вывод, что инфицирование BVDV швейцарских диких жвачных животных носит спорадический характер, в связи с чем дикие жвачные в настоящее время являются случайными переносчиками вируса, а не резервуарами для BVDV в Швейцарии [20].

К разным выводам пришли испанские учёные в 2016 и 2019 гг. X. Fernández-Aguilar и соавт. полагают, что пестивирусные инфекции у диких жвачных животных спорадические и, скорее всего, дикие животные заражаются исключительно от домашнего скота, а не наоборот [21]. В то же время V. Rodríguez-Prieto и соавт. утверждают, что BVDV циркулирует между популяциями КРС и благородного оленя (Cervus elaphus) и необходимы дальнейшие исследования для изучения роли благородного оленя как резервуара BVDV [22]. C этим выводом согласны и итальянские учёные, которые в 2019 г. сделали вывод о широком распространении BVDV в дикой фауне. Субгенотип BVDV-1c был впервые обнаружен у косули (Capreolus capreolus) и апеннинской серны (Rupicapra pyrenaica ornata) в Центральной Италии. В связи с этим авторы призывают к более детальному изучению роли этих животных в эпизоотологии ВД КРС [23].

Помимо исследований, посвящённых изучению распространения конкретного возбудителя, в литературе не менее широко описаны случаи регистрации ассоциаций возбудителей вирусной природы в одной и той же популяции диких парнокопытных животных. В частности, довольно часто встречаются упоминания об одновременном выявлении BoHV-1 и BVDV [24, 25].

Результаты приведённых исследований свидетельствуют о том, что BoHV-1 и BVDV в разной мере присутствуют в популяции диких жвачных животных по всему миру, в то время как в работах отечественных учёных этот вопрос затрагивается только поверхностно, а полномасштабные исследования распространённости вирусных патогенов КРС в популяции диких жвачных животных России единичны [26, 27].

Целью данной работы было изучение распространённости α-герпесвирусов КРС и пестивирусов КРС в популяции диких парнокопытных животных Московской области.

Материалы и методы

Пробы патологического материала (кусочки паренхиматозных органов, смывы со слизистой оболочки носовой полости, кровь из сердца) отбирались от диких парнокопытных животных, отстрелянных в зимние сезоны охоты 2019–2022 гг. на территории Московской области. Отбор проб проводили посмертно ветеринарные врачи Государственной ветеринарной службы Московской области. Всего было отобрано 460 проб от 124 животных, в том числе:

– от 99 лосей (Alces alces);

– 15 косуль (Capreolus capreolus);

– 10 животных без информации о виде.

Все особи на основе морфологических характеристик (размер тела, износ зубов, рост рогов) были разделены на три возрастные категории: оленёнок (менее 1 года), годовалый (от 1 до 2 лет) и взрослый (более 2 лет). Большинство животных были взрослыми особями (n = 68), значительно меньше исследовано годовалых (n = 16) и оленят (n = 14). Для 26 животных примерный возраст в сопроводительных документах не был указан. Самцы (n = 55) и самки (n = 54) были представлены практически одинаково, в 26 случаях, включённых в исследование, половая принадлежность животных в сопроводительных документах была не указана.

От указанных животных был исследован 371 образец внутренних органов (носовая перегородка, верхние кольца трахеи, кусочки лёгкого, сердца, печени, почки), 48 проб смывов со слизистых и 41 проба сыворотки крови (кровь отбиралась посмертно пункцией полостей сердца). Образцы замораживали при температуре –80 °С. В ходе пробоподготовки из тканей органов вырезали фрагмент объемом 1 см³, который измельчали на гомогенизаторе Homogenizer type 302 (Mechanika Precyzyjna, Польша) в 10 мл физиологического раствора с добавлением 100 мг стрептомицина и 100 ЕД пенициллина. В дальнейшем гомогенат центрифугировали на центрифуге ОПн-8УХЛ4.2 (Россия) при 3000 об/мин в течение 5 мин, супернатант отбирали и использовали для дальнейших исследований.

Авторы подтверждают соблюдение институциональных и национальных стандартов по использованию лабораторных животных в соответствии с “Consensus author guidelines for animal use” (IAVES 23 July 2010). Протокол исследования одобрен Этическим комитетом ФГБУ «Всероссийский государственний Центр качества и стандартизации лекарственных средств для животных и кормов» (Протокол № 125 от 16 апреля 2020 г).

Культура клеток. Для репродукции вирусов использовалась перевиваемая культура клеток почки телёнка (MDBK).

Вирус. В работе использовался полевой изолят вируса ИРТ КРС «Куйбышев-2006» и цитопатогенный штамм вируса ВД КРС Т-04 из коллекции ФГБНУ «Федеральный научный центр – Всероссийский научно-исследовательский институт экспериментальной ветеринарии имени К.И. Скрябина и Я.Р. Коваленко Российской академии наук».

Культивирование клеток. Культивирование проводили в полистироловых культуральных матрасах с площадью роста 75 см² и невентилируемой крышкой в условиях термостата при 37 °С. В качестве ростовой питательной среды использовали среды Игла DМЕМ («ПанЭко», Россия) с добавлением 7% сыворотки КРС (HyClone, США). Пересев культуры проводили 1 раз в неделю в соотношении 1 : 4.

Заражение культуры вирусами. Заражение культуры клеток проводили после формирования полного монослоя на 1–2-й день после пересева клеток. Ростовую питательную среду сливали. Клеточный монослой дважды отмывали питательной средой Игла DМЕМ. После этого в матрас вносили вируссодержащей материал из расчета 1,0 ТЦД₅₀/кл и помещали в термостат при 37 °С на 1 ч. Через 1 ч содержимое матраса сливали, а в матрас вносили поддерживающую питательную среду (Игла DМЕМ без добавления сыворотки) без предварительного промывания монослоя. После этого матрас помещался в отдельный термостат при 37 °С. Цитопатическое действие вирусов учитывали ежедневно визуально под малым увеличением инвертированного микроскопа до отслоения большей части монослоя от субстрата. Вируссодержащую суспензию использовали в дальнейших исследованиях. Определение инфекционного титра вируса проводили по методу Рида и Менча.

Реакция нейтрализации. Реакцию нейтрализации с постоянной дозой вируса 2 lg ТЦД₅₀/мл проводили микрометодом, используя полистироловые 96-луночные культуральные планшеты. Каждая проба сыворотки крови исследовалась в двух повторах по три разведения в каждом (1 : 2 – 1 : 8). Результаты учитывали через 72 ч после постановки реакции. Учитывая низкое качество и количество сыворотки в предоставленных пробах, а также невозможность повторного отбора проб у тех же животных, учёт результатов реакции проводился качественно (без расчёта титра антител в исследуемой сыворотке). Животное считалось серопозитивным при получении положительного результата (отсутствие цитопатического действия вируса) хотя бы в первом разведении сыворотки одного из повторов.

Полимеразная цепная реакция. Выделение нуклеиновых кислот проводили из 100 мкл образца с помощью набора «РИБО-преп» (ФБУН «Центральный научно-исследовательский институт эпидемиологии Роспотребнадзора» (ЦНИИЭ), Россия) по инструкции производителя. ПЦР для выявления ДНК герпесвирусов КРС проводили с использованием тест-системы «РИНОКОР» (ФБУН ЦНИИЭ, Россия). Для идентификации родственных α-герпесвирусов проводили амплификацию участка гена gB вирусов с использованием гнездовой ПЦР с праймерами CR30, CR31, CR32, CR33 [28]. Первый раунд с праймерами CR30, CR31 проводили в 25 мкл реакционной смеси, содержащей 2,5× PCR-mix2 blue («АмплиСенс», Россия), 0,25 мМ dNTP, 0,6 мкМ прямого и обратного праймера и 10 мкл выделенной из образца ДНК. Реакцию проводили в амплификаторе «Терцик» («ДНК-технология», Россия) по следующей программе: 5 мин – 95 °С, 40 циклов (20 сек – 95 °С, 20 сек – 61 °С, 30 сек – 72 °С), 5 мин – 72 °С. Второй раунд с праймерами CR32, CR33 проводили в аналогичной смеси по программе: 5 мин – 95°С, 40 циклов (20 сек – 95°С, 20 сек – 63 °С, 20 сек – 72 °С), 5 мин – 72 °С с использованием в качестве матрицы 1 мкл реакционной смеси первого раунда.

Секвенирование очищенных ампликонов проводили с использованием набора реагентов BrilliantDye V3.1 на генетическом анализаторе Applied Biosystems 3100 Genetic Analyzer (Life Technologies, США). Полученные нуклеотидные последовательности анализировали с помощью алгоритма BLAST на поисковом интернет-ресурсе National Center for Biotechnology Information (www.ncbi.nlm.nih.gov).

Для выявления генетического материала BVDV использовали методику, разработанную в ФГБУ «Всероссийский государственный центр качества и стандартизации лекарственных средств для животных и кормов» для выявления генетического материала вирусов рода Pestivirus (групп A, B, C, D, H) в ПЦР с обратной транскрипцией (ОТ-ПЦР) в режиме реального времени [29]. Амплификацию и детекцию продуктов ПЦР и ОТ-ПЦР проводили в режиме реального времени на приборе RotorGene Q (QIAGEN GmbH, Германия).

Статистическая обработка результатов. Статистическая обработка результатов и построение диаграмм проводились в программе Microsoft Excel 2016.

Картографический анализ. Карты строили в программе ArcGIS10.8.

Результаты

Из 124 парнокопытных, добытых на территории Московской области, пробы сыворотки крови отобраны только у 41 животного, в том числе от 36 лосей и 5 косуль. Трудности с отбором были связаны с большим промежутком времени между гибелью животного и проведённым отбором проб, а также с низкой температурой воздуха в зимний период, что приводило к частичному гемолизу крови, полученному незначительному объёму сыворотки и, как следствие, определёнными трудностями при её исследовании в реакции нейтрализации. В образцах сыворотки 19 животных (16 лосей, 3 косули) были детектированы антитела к α-герпесвирусам КРС. Антитела к пестивирусам КРС детектированы в сыворотке крови 12 лосей. При этом антитела к обеим группам возбудителей определены в сыворотке крови 8 лосей.

В результате молекулярно-генетических исследований (ПЦР) 371 образца патологического материала и 48 проб смывов со слизистых от 124 диких парнокопытных, добытых на территории Московской области, ДНК α-герпесвирусов КРС была выявлена в образцах от 5 животных:

– в носовых смывах 2 косуль, добытых в 2019 г. на территории г.о. Луховицы;

– в образцах органов 2 лосей (в образце лёгкого одного, а также в образцах почки и сердца другого животного), добытых в 2022 г. на территории г.о. Ступино;

– в носовом смыве 1 косули, добытой в 2022 г. на территории г.о. Серпухов.

Анализ нуклеотидных последовательностей фрагмента гена gB, полученных в результате секвенирования продуктов ПЦР с общими для α-герпесвирусов праймерами, подтвердили наличие ДНК BoHV-5 в образце носового смыва от косули и ДНК BoHV-1 в двух пробах органов лосей, отстрелянных в 2022 г. Для проб животных, добытых в 2019 г., из-за низкого качества образцов не удалось провести идентификацию вирусов герпеса.

В носовом смыве лося, добытого в 2022 г. на территории г.о. Серпухов, детектирован генетический материал BVDV.

Локация добычи указанных животных отображена на карте Московской области (рис. 1).

 

Рис. 1. Места добычи животных, в материале которых детектирован генетический материал α-герпесвирусов КРС и пестивирусов КРС, в Московской области. Fig. 1. Locations in Moscow Region where were shot animals in which samples the genetic material of cattle α-herpesviruses and cattle pestiviruses has been detected.

 

Обсуждение

Результаты, полученные в ходе исследования проб патологического материала от диких парнокопытных животных на территории Московской области, позволяют утверждать о циркуляции α-герпесвирусов КРС и пестивирусов КРС среди этих животных.

По результатам серологических исследований, общая серопревалентность диких парнокопытных Московской области к α-герпесвирусам КРС составила 46%. Серопревалентность к пестивирусам КРС составила 29%. Эти цифры варьируют в разных районах и городских округах области, но в целом положительные результаты были выявлены в районах наибольшего числа отобранных проб (рис. 2 и 3).

 

Рис. 2. Места отстрела животных, в сыворотке крови которых детектированы антитела к α-герпесвирусам КРС и пестивирусам КРС, в Московской области. Fig. 2. Locations in Moscow Region where were shot animals in which sera antibodies to cattle α-herpesviruses and cattle pestiviruses have been detected.

 

Рис. 3. Регионы Московской области, где проведён отбор проб сыворотки крови и сравнение общего количества исследованных проб и проб, в которых детектированы антитела к α-герпесвирусам КРС и пестивирусам КРС. Fig. 3. Territories of the Moscow Region where serum samples were obtained and the comparison of total number of samples studied and samples in which antibodies to cattle α-herpesviruses and cattle pestiviruses were detected.

 

Антитела к α-герпесвирусам КРС и пестивирусам КРС чаще детектировали у взрослых животных (11 и 5 положительных проб соответственно), чем у оленят (6 и 4 положительные пробы соответственно), количество серопозитивных самцов и самок было практически одинаковым. Реже всего антитела выявляли у годовалых животных (2 и 1 положительная проба). Кроме того, антитела к пестивирусам КРС детектированы у 2 животных, возрастная категория которых не была определена из-за отсутствия соответствующей информации (рис. 4). Полученные различия в серопозитивности возрастных групп животных можно объяснить неравномерностью выборки, а также особенностями социальной структуры групп оленьих в зимнее время, которые были описаны нами ранее [30].

 

Рис. 4. Распределение общего количества проб сыворотки крови к количеству проб, в которых детектированы антитела к α-герпесвирусам КРС и пестивирусам КРС, по видовым, возрастным и половым особенностям добытых животных. Fig. 4. Distribution of the serum samples in which antibodies to cattle α-herpesviruses of and cattle pestiviruses of were detected, in general and depending on species, age and gender characteristics of the animals.

 

К сожалению, только по результатам серологических исследований, несмотря на факт отсутствия вакцинации, мы не можем точно установить носительство дикими парнокопытными Московской области возбудителя ИРТ КРС – герпесвируса КРС 1-го типа. Детектированные нами в 46% исследованных проб антитела могли выработаться в организме в ответ на инфицирование любым α-герпесвирусом КРС. Для точной дифференцировки J. Thiry и соавт. в своей работе рекомендует проводить идентификацию предварительно изолированного из патологического материала возбудителя в реакции иммунофлуоресценции с моноклональными антителами [12]. Но в нашей работе изоляция возбудителей из патологического материала не проводилась.

Тем не менее мы с уверенностью можем утверждать, что герпесвирусы КРС 1-го и 5-го типа циркулируют в популяции диких парнокопытных животных на территории Московской области. Об этом говорит факт детекции генетического материала этих возбудителей в образцах материала от 3 диких парнокопытных животных. Специфичность ПЦР-исследований и описанная возможность молекулярно-генетической дифференциации родственных α-герпесвирусов, на которую указывают многие иностранные авторы [28, 31, 32], позволяет нам предположить, что циркуляция возбудителя ИРТ КРС возможна у диких копытных и на других территориях Московской области, на которых сконцентрировано относительно большее количество животных.

Факт детекции антител к пестивирусам КРС в 12 пробах сыворотки крови (серопревалентность 29%) и генетического материала BVDV в образце от одного животного говорит о циркуляции BVDV в популяции диких жвачных парнокопытных Московской области.

Заключение

По результатам наших исследований, серопревалентность диких парнокопытных Московской области к α-герпесвирусам КРС выше, чем к пестивирусам КРС. Антитела к α-герпесвирусам детектированы в 46% исследуемых проб сыворотки крови диких животных, к пестивирусам – в 29%. Такое соотношение положительных проб коррелируют с данными, полученными европейскими коллегами в разных странах [21, 25], что в целом позволяет согласиться с их выводами о роли диких жвачных животных как резервуарных хозяев исследуемых возбудителей: скорее всего, дикие жвачные могут быть естественным резервуаром BoHV-1 и других α-герпесвирусов, и этот факт необходимо учитывать при организации мероприятий по контролю и ликвидации ИРТ КРС в животноводческих хозяйствах. В связи с более редкими случаями инфицирования оленьих BVDV для выводов о роли диких парнокопытных животных в эпизоотологии ВД КРС необходимы дополнительные исследования.

Об авторах

Александр Владимирович Пчельников

ФГБУ «Всероссийский государственный центр качества и стандартизации лекарственных средств для животных и кормов» Федеральной службы по ветеринарному и фитосанитарному надзору (Россельхознадзор); ФГБОУ ВО «Московская государственная академия ветеринарной медицины и биотехнологии – МВА имени К.И. Скрябина» Министерства сельского хозяйства Российской Федерации

Автор, ответственный за переписку.
Email: vetdr-mom@list.ru
ORCID iD: 0000-0002-9712-3079

кандидат ветеринарных наук, доцент кафедры эпизоотологии и организации ветеринарного дела; специалист 1 категории

Россия, 123022, г. Москва; 109472, г. Москва

Светлана Петровна Яцентюк

ФГБУ «Всероссийский государственный центр качества и стандартизации лекарственных средств для животных и кормов» Федеральной службы по ветеринарному и фитосанитарному надзору (Россельхознадзор); ФГБОУ ВО «Московская государственная академия ветеринарной медицины и биотехнологии – МВА имени К.И. Скрябина» Министерства сельского хозяйства Российской Федерации

Email: pcr-lab@vgnki.ru
ORCID iD: 0000-0002-4819-2131
SPIN-код: 9853-2024

кандидат биологических наук, заведующий отелом генодиагностики инфекционных болезней животных; доцент кафедры биологической безопасности объектов ветеринарного надзора и обращения лекарственных средств в ветеринарии

Россия, 123022, г. Москва; 109472, г. Москва

Мария Сергеевна Красникова

ФГБУ «Всероссийский государственный центр качества и стандартизации лекарственных средств для животных и кормов» Федеральной службы по ветеринарному и фитосанитарному надзору (Россельхознадзор)

Email: m.krasnikova@vgnki.ru
ORCID iD: 0000-0002-6248-419X

кандидат биологических наук, старший научный сотрудник отела генодиагностики инфекционных болезней животных

Россия, 123022, г. Москва

Список литературы

Дополнительные файлы