Хантавирусы (Hantaviridae: Orthohantavirus), циркулирующие среди насекомоядных на Дальнем Востоке России

Полный текст

Введение

Хантавирусы, принадлежащие семейству Hantaviridae рода Orthohantavirus, широко распространены во многих регионах мира и являются возбудителями двух клинических форм заболевания человека – геморрагической лихорадки с почечным синдромом и хантавирусного кардио-лёгочного синдрома, для которых международным сообществом хантавирусологов предлагается использовать новый общий термин – хантавирусное заболевание [1]. Со времён открытия первого хантавируса от полевой мыши грызуны отряда Rodentia считались основным природным резервуаром хантавирусов, однако исследования последних лет установили более широкий круг млекопитающих хозяев, включая насекомоядных (отряд Eulipotyphla) и рукокрылых (отряд Chiroptera) [2].

Активное изучение хантавирусов в новых природных резервуарах, их видового состава, распространения и патогенного потенциала привело к открытию 26 новых хантавирусов среди насекомоядных и 7 видов среди летучих мышей в географически удалённых районах на трёх континентах [3]. Наиболее важным фактом явилось серологическое доказательство инфицирования людей хантавирусами, циркулирующими среди насекомоядных и рукокрылых в Азии и Африке [4, 5].

В России исследования проводились на территории азиатской части страны. В Сибири среди насекомоядных были обнаружены пять хантавирусов: Сивис (SWSV), Алтай (ALTV), Артыбаш (ARTV), Кенкеме (KKMV), Академ (ACDV). Вирус SWSV, первоначально выявленный на территории Европы от обыкновенных бурозубок (Sorex araneus), широко распространён на территории Сибири от Омской области до озера Байкал [6]. SWSV был обнаружен в нескольких видах бурозубок рода Sorex, включая обыкновенную, тундряную (S. tundrensis) и крупнозубую (S. daphaenodon). В дополнение к SWSV, относящемуся к роду Orthohantavirus, в обыкновенной бурозубке в Республике Алтай и Томской области был открыт ранее неизвестный значительно отличающийся вирус, названный вирусом Алтай (ALTV) [7, 8]. Филогенетический анализ показал, что новый вирус наиболее близок к роду Mobatvirus, включающему в основном хантавирусы от летучих мышей, что указывает на межвидовой переход в ходе его эволюции [8]. В популяциях средних бурозубок (S. caecutiens) Республики Алтай и Красноярского края был обнаружен вирус Артыбаш (ARTV) [9]. Согласно новой классификации, вирус ARTV отнесён к отдельному генетическому варианту ARTV-Sc вируса SWSV [10]. На территории Алтайского края среди плоскочерепных бурозубок (S. roboratus) выявлен вирус Кенкеме (KKMV), впервые найденный в том же виде носителей в Республике Саха [11, 12]. Недавние исследования сибирских кротов (Talpa altaica) на территории Западной Сибири установили среди них циркуляцию ранее неизвестного вируса Академ (ACDV) [13].

На Дальнем Востоке России в южной части Хабаровского края и Республике Саха были выявлены и идентифицированы четыре вида хантавирусов. Совместная циркуляция двух значительно различающихся вирусов Лена (LENV) и варианта ARTV-Sc вируса SWSV была обнаружена в популяциях средней бурозубки (S. caecutiens) в Хабаровском крае и Республике Саха [7, 14]. На основе получения и анализа полноразмерных геномов выдвинута гипотеза, что хантавирусы ALTV и LENV возникли в ходе эволюции в результате межвидового перехода предкового хантавируса летучих мышей к насекомоядным и его последующего распространения среди бурозубок рода Sorex на территории Евразии [8]. Второй генетически различающийся вариант вируса SWSV, ранее называемый ARTV-St, был обнаружен среди S. tundrensis на юге Хабаровского края [14]. В Хабаровском крае и Республике Саха среди плоскочерепных бурозубок установлена циркуляция вируса KKMV, а в Хабаровском крае в таежных бурозубках (S. isodon) был найден вирус Yakeshi (YKSV), ранее выявленный в том же носителе на приграничной территории Китая [11, 14, 15].

Целью исследования было дальнейшее изучение циркуляции хантавирусов среди насекомоядных на территории Дальнего Востока, их видового состава и распространения.

Материалы и методы

Экспедиции по отлову мелких млекопитающих и сбору образцов были проведены в период 2011, 2015–2017 гг. на территории Дальнего Востока России. Отлов мелких млекопитающих и отбор образцов осуществляли в соответствии с протоколом и рекомендациями по безопасной работе согласно МУ 3.1.1029-01 (утв. 06.04.2001 г.). Авторы подтверждают соблюдение институциональных и национальных стандартов по использованию лабораторных животных в соответствии с Consensus Author Guidelines for Animal Use (IAVES, 2010, July 23). Отобранные ткани лёгких помещали в жидкий азот либо в стабилизирующий раствор RNAlater (QIAGEN GmbH, Германия) для последующего выделения РНК и её анализа методом полимеразной цепной реакции с обратной транскрипцией (ОТ-ПЦР). Для подтверждения таксономической принадлежности бурозубок, определённой экспертами-зоологами, было проведено определение и сравнение с базой данных GenBank фрагмента гена цитохрома b митохондриальной ДНК.

Вирусную кДНК (комплементарную) синтезировали с использованием ОТ Thermo Scientific RevertAid Premium Reverse Transcriptase (Thermo Fisher Scientific, США) и родоспецифического праймера HPS (5’-TAGTAGTAGACTCC). Продукты двухраундовой амплификации получали с использованием двух серий праймеров по стандартному протоколу с использованием Hot start Taq ДНК-полимеразы производства фирмы «СибЭнзайм» (Новосибирск). Первая серия праймеров и условия проведения реакции были описаны ранее [16], вторая серия праймеров была выбрана авторами и описана в работе L.N. Yashina и соавт. [8].

Выравнивание нуклеотидных последовательностей осуществляли с помощью алгоритма MUSCLE в программе MEGA X [17]. Для построения филогенетических деревьев использован метод максимального правдоподобия (Maximum Likelihood) с моделью эволюции GTR + G + I. Вычисления проводили для 1000 итераций.

Результаты

В период 2011 и 2015–2017 гг. в Еврейской автономной области (ЕАО), Приморском и Хабаровском краях, Сахалинской области было отловлено 43 бурозубки (рис. 1, таблица). Все образцы были протестированы методом ОТ-ПЦР с использованием праймеров для L-сегмента генома. Хантавирусная РНК была выявлена в образцах от 13 бурозубок, отловленных во всех исследованных регионах в 7 из 9 выбранных точек: окрестностях Биробиджана, Ленинского, Николаевки (ЕАО); Токи и Ландыши (Хабаровский край), Владивостока (Приморский край), Холмска (Сахалинская область) (таблица). РНК-положительный образец с острова Сахалин дополнительно анализировали с использованием праймеров к S-сегменту генома. Полученные нуклеотидные последовательности депонированы в банке данных GenBank под номерами MG888369 – MG888373, MG888375, MG860921, MZ062428 – MZ062433, ON858829. Филогенетический анализ частичной 426-нуклеотидной последовательности гена цитохрома b идентифицировал носителей вируса как S. tundrensis, S. caecutiens, S. roboratus и S. unguiculatus (номера в банке данных MG888386, MG888400 – MG888401, ON858826 – ON858828).

 

Рис. 1. Расположение точек отлова на территории Дальнего Востока России (включая ранее проведённые исследования), где были выявлены инфицированные хантавирусами бурозубки рода Sorex: 1) Ленинское, 2) Биробиджан, 3) Николаевка, 4) Хехцир, 5) Галкино, 6) Ландыши, 7) Токи, 8) окрестности Владивостока, 9) Холмск. Идентифицированные хантавирусы обозначены цветом: SWSV/ARTV-Sc (синий), SWSV/ARTV-St (зеленый), KKMV (сине-зеленый), YKSV (малиновый), LENV (красный).

Fig. 1. The locations of the collection sites in the Far East of Russia (including previous studies), where hantavirus-infected shrews of genus Sorex were captured: 1) Leninskoye, 2) Birobidzhan, 3) Nikolaevka, 4) Khekhtsir, 5) Galkino, 6) Lili, 7) Toki, 8) suburbs of Vladivostok City, 9) Holmsk. Detected hantaviruses are designated with following colors: SWSV/ARTV-Sc (dark blue), SWSV/ARTV-St (green), KKMV (blue), YKSV (magenta), LENV (red).

 

Таблица. Выявление инфицированных хантавирусами бурозубок рода Sorex методом ОТ-ПЦР на Дальнем Востоке России

Table. Prevalence of hantavirus infection as determined by RT-PCR in Sorex species in the Russian Far East

Регион Region	Место отлова Trap locality	Вид Species	Год Year	Число положительных/ исследованных РНК Hantavirus Positive/Tested for RNA	Вирус Virus
Еврейская автономная область Jewish Autonomous region	Ленинское Leninskoye	S. tundrensis	2016	2/5	ARTV-St
	Биробиджан Birobidzhan	S. tundrensis	2016	2/5	ARTV-St
	Николаевка Nikolaevka	S. tundrensis	2016	1/2	ARTV-St
		S. caecutiens	2016	1/2	ARTV-Sc
		S. roboratus	2017	1/1	KKMV
	Приамурское Priamurskoye	S. tundrensis	2017	0/2	–
		S. caecutiens	2017	0/2	–
Хабаровский край Khabarovsk Krai	Токи Toki	S. caecutiens	2011	1/4	ARTV-Sc
		S. caecutiens	2017	1/1	ARTV-Sc
	Ванино Vanino	S. caecutiens S. daphaenodon S. unguiculatus S. caecutiens	2011 2011 2011 2017	0/1 0/1 0/1 0/3	–
	Ландыши Landyshi	S. caecutiens	2011	1/1	ARTV-Sc
Приморский край Primorsky Krai	Владивосток Vladivostok	S. caecutiens	2015	2/6	ARTV-Sc
Сахалинская область Sakhalin region	Холмск Holmsk	S. unguiculatus	2015	1/6	YKSV

 

Филогенетический анализ, основанный на фрагментах 346 нуклеотидных остатков (н.о.) L-сегмента генома, выявил среди новых РНК-изолятов три вида хантавирусов: варианты вируса SWSV (ARTV-Sc и SWSV-St), KKMV и YKSV (рис. 2). Анализ нуклеотидных последовательностей 6 РНК-изолятов от S. caecutiens показал их принадлежность к вирусу SWSV (ARTV-Sc), ранее выявленному от средних бурозубок в окрестностях Хабаровска и в Республике Саха [7, 14]. Установлено, что новые вирусные последовательности от S. caecutiens образуют две генетические подгруппы, отличающиеся по нуклеотидным последовательностям на 8,5–9,8%. РНК-изоляты от средних бурозубок, отловленных на побережье Хабаровского и Приморского краёв, близки к генетическому варианту вируса из окрестностей Хабаровска (Galkino-Sc2712) и отличаются от РНК-изолятов вируса из географически более удалённой Республики Саха (MSB8558) на 12,7–15,0%. РНК-изолят Nikolaevka-Sc667 из ЕАО наиболее близок второй дальневосточной подгруппе, включающей образцы из Большехехцирского заповедника Хабаровского края (Khekhtsir-Sc1126).

 

Рис. 2. Филогенетическое дерево, отображающее взаимосвязи российских РНК-изолятов хантавирусов, ассоциированных с бурозубками рода Sorex (зелёный шрифт), выявленных на Дальнем Востоке России, и штаммов хантавирусов из других регионов мира от насекомоядных, грызунов и летучих мышей. Деревья построены на основе фрагмента L-сегмента генома методом максимального правдоподобия с использованием модели GTR + I + Γ, индексы поддержки рассчитаны для 1000 повторов. Жирным шрифтом и кружком выделены исследованные РНК-изоляты хантавирусов.

Fig. 2. Phylogenetic tree of Sorex-borne hantaviruses (colored in green) identified in the Far East of Russia in relationship to strains from insectivores, rodents and bats from other regions of the world. Tree, generated by maximum-likelihood method, was based on the L segment sequences, under the best-fit GTR + I + G model with 1000 bootstrap replicates. Strains from this study are shown in bold lettering and circles.

 

Новые нуклеотидные последовательности вируса SWSV, обнаруженные в образцах от S. tundrensis (вариант ARTV-St) из ЕАО, группируются с последовательностью от того же вида носителей (Galkino-St2714) из Хабаровска, уровень их различия не превышает 5,6%. Различие РНК-изолятов вируса SWSV от двух видов носителей – S. caecutiens и S. tundrensis – составило 19,3–20,9% для нуклеотидных и 1,7–2,6% для аминокислотных последовательностей.

Анализ нуклеотидной последовательности, полученной из тканей лёгких S. roboratus, отловленной в ЕАО (Nikolaevka-Sr963), установил её принадлежность к вирусу KKMV (рис. 2). Новая нуклеотидная последовательность отличалась от ранее опубликованных из Хабаровска (Galkino-Sr700) и Китая (Fuyuan-Sr326) на 0,7–2,9% и значительно сильнее (15,7–17,6%) – от географически удалённых изолятов из Алтайского края (Solton-Sr54) и Республики Саха (MSB148794). Различие аминокислотных последовательностей составило 0,9–1,7%.

Вирусная последовательность, выявленная от когтистой бурозубки (S. unguiculatus) с острова Сахалин, филогенетически группируется с изолятами вируса YKSV от S. isodon, ранее найденными в окрестностях Хабаровска (Khekhtsir-Si71, Khekhtsir-Si373) и Китае (Si-210). Уровень различия изолятов вируса YKSV от разных природных носителей составил для L-сегмента 16,0–18,6% для нуклеотидных и 2,8–3,5% – для аминокислотных последовательностей. Анализ последовательности S-сегмента генома (730 н.о.) нового изолята Sakhalin-Su353 выявил 18,9–20,4% нуклеотидных и 3,5% аминокислотных различий в сравнении с последовательностями от S. isodon.

Обсуждение

Среди отловленных средних бурозубок не был обнаружен вирус LENV, что могло быть связано с ограниченным числом исследованных животных. Согласно нашим данным, уровень инфицированности бурозубок вирусом LENV относительно низок [14]. Ранее вирус LENV был обнаружен в одном образце от S. caecutiens, отловленных в окрестностях Хабаровска, в то время как ARTV-Sc найден в пяти из тех же 59 исследованных образцов. Одна из возможных причин – различная чувствительность к вирусам у природных носителей за счёт разной эволюционной истории. Вирусы SWSV, KKMV и YKSV филогенетически отнесены к роду Orthohantavirus. Долговременная коэволюция между вирусом SWSV (вариант ARTV-Sc) и его хозяином обеспечивает лучшую восприимчивость носителя к вирусу SWSV (ARTV-Sc) по сравнению с LENV (род Mobatvirus), для которого выявлен межвидовой переброс от другого хозяина в ходе эволюционной истории. Эта гипотеза требует дальнейшей проверки, включая изоляцию вирусов.

Заключение

Таким образом, нами показано широкое распространение хантавируса SWSV (вариант ARTV-Sc) в популяциях средних бурозубок в новых очагах на территории ЕАО, Хабаровского и Приморского краёв и вирусов SWSV (вариант ARTV-St) и KKMV в ЕАО среди тундряных и плоскочерепных бурозубок соответственно. На острове Сахалин обнаружен новый вариант вируса YKSV и его новый природный носитель – S. unguiculatus в дополнение к ранее известному носителю S. isodon, населяющему материковую часть Дальнего Востока России. Полученные результаты свидетельствуют о коэволюции хантавирусов SWSV, KKMV и YKSV с природными носителями в ареалах их обитания.

 

Участие авторов: Яшина Л.Н. – концепция и дизайн исследования, проведение экспериментов, сбор, анализ и интерпретация данных, подготовка текста; Иванов Л.И. – концепция и дизайн исследования, проведение экспериментов, сбор, анализ и интерпретация данных, подготовка текста; Компанец Г.Г., Здановская Н.И., Карташов М.Ю. – проведение экспериментов.

Финансирование. Исследование выполнено за счёт государственного бюджета.

Конфликт интересов. Авторы заявляют об отсутствии конфликта интересов.

Этическое утверждение. Авторы подтверждают соблюдение институциональных и национальных стандартов по использованию лабораторных животных в соответствии с Consensus Author Guidelines for Animal Use (IAVES, 2010, July 23). Протокол исследования одобрен Этическим комитетом ФГАОУ ВО «Дальневосточный федеральный университет» (протокол № 1 от 01.04.2011).

Contribution: Yashina L.N. – the study concept and design, conducting of the experiments, collection, analysis and interpretation of the data, preparing of the text; Ivanov L.I. – the study concept and design, conducting of the experiments, collection, analysis and interpretation of the data, preparing of the text; Kompanets G.G., Zdanovskaya N.I., Kartashov M.Yu. – conducting of the experiments.

Funding. The research was funded by the state budget.

Conflict of interest. The authors declare no conflict of interest.

Ethics approval. Авторы подтверждают соблюдение институциональных и национальных стандартов по использованию лабораторных животных в соответствии с Consensus Author Guidelines for Animal Use (IAVES, 2010, July 23). The research protocol was approved by the Ethics Committee of the Far Eastern Federal University (protocol No. 1 dated Apr 1, 2011).

Об авторах

Л. Н. Яшина

ФБУН «Государственный научный центр вирусологии и биотехнологии «Вектор» Роспотребнадзора

Автор, ответственный за переписку.
Email: yashina@vector.nsc.ru
ORCID iD: 0000-0003-2844-7835

доктор биологических наук, ведущий научный сотрудник

Россия, 630559, р.п. Кольцово, Новосибирская область

Л. И. Иванов

ФКУЗ «Хабаровская противочумная станция» Роспотребнадзора

Email: yashina@vector.nsc.ru
ORCID iD: 0000-0003-0349-837X

врач-вирусолог

Россия, 680031, г. Хабаровск

Г. Г. Компанец

ФГАОУ ВО «Дальневосточный федеральный университет»

Email: yashina@vector.nsc.ru
ORCID iD: 0000-0001-7315-6119

кандидат медицинских наук, доцент Департамента фундаментальной медицины Школы медицины

Россия, 690950, г. Владивосток

Н. И. Здановская

ФКУЗ «Хабаровская противочумная станция» Роспотребнадзора

Email: yashina@vector.nsc.ru
ORCID iD: 0000-0001-5507-7521

врач-вирусолог

Россия, 680031, г. Хабаровск

М. Ю. Карташов

ФБУН «Государственный научный центр вирусологии и биотехнологии «Вектор» Роспотребнадзора

Email: yashina@vector.nsc.ru
ORCID iD: 0000-0002-7857-6822

кандидат биологических наук, старший научный сотрудник

Россия, 630559, р.п. Кольцово, Новосибирская область

Список литературы

Дополнительные файлы