Штаммы диплоидных клеток лёгкого летучей мыши Pipistrellus pipistrellus и их пермиссивность к орбивирусам (Reoviridae: Orbivirus) – возбудителям трансмиссивных болезней животных

Обложка


Цитировать

Полный текст

Аннотация

Введение. Культуры клеток летучих мышей являются востребованной моделью как для изоляции вирусов трансмиссивных болезней, так и для оценки возможной роли данных видов млекопитающих в формировании природных резервуаров переносчиков возбудителей арбовирусных инфекций.

Цель исследования. Получение и характеристика штаммов диплоидных клеток лёгкого летучей мыши Pipistrellus pipistrellus, оценка их пермиссивности к вирусам блютанга, африканской чумы лошадей (АЧЛ), эпизоотической геморрагической болезни оленей (ЭГБО).

Материалы и методы. Культуры клеток лёгкого нетопыря-карлика получали методом стандартной ферментативной дезагрегации ткани доноров и селекцией клеток по адгезивным свойствам. Биологические свойства штаммов клеток изучены цитологическими, кариологическими методами. Пермиссивность культур клеток определяли к орбивирусам блютанга, АЧЛ, ЭГБО.

Результаты. Диплоидные штаммы клеток (эпителиоподобного и фибробластоподобного типа), сохраняющие цитоморфологические характеристики и стабильность кариотипа, получены из ткани лёгкого нетопыря-карлика Pipistrellus pipistrellus. Установлена их пермиссивность к вирусам рода Orbivirus семейства Reoviridae возбудителям трансмиссивных заболеваний животных. Паспортизированные штаммы диплоидных клеток чувствительны к орбивирусам блютанга, АЧЛ, ЭГБО. Инфекционная активность вирусов в эпителиоподобной культуре клеток соответствовала активности в референтных культурах Vero и CV-1. Фибробластоподная культура клеток была менее пермиссивна к вирусам блютанга и ЭГБО, однако накопление вируса АЧЛ было выше на 1,52,0 lg ТЦД50/см3.

Обсуждение. Пермиссивность полученных штаммов клеток лёгкого летучей мыши Pipistrellus pipistrellus к вирусам блютанга, АЧЛ, ЭГБО согласуется с данными изоляции орбивирусов у летучих мышей видов Pteropus poliocephalus, Pteropus hypomelanus, Rousettus aegyptiacus leachii, Syconycteris crassa, Myotis macrodactylus, Eidolon helvum.

Заключение. Штаммы диплоидных клеток лёгкого нетопыря-карлика пермиссивны к орбивирусам блютанга, АЧЛ, ЭГБО, что позволяет рекомендовать их для изоляции этих вирусов, а вид Pipistrellus pipistrellus рассматривать как потенциальный природный резервуар и переносчик возбудителей данных трансмиссивных болезней.

Полный текст

Введение

Арбовирусные инфекции занимают существенное положение в структуре вирусной патологии млекопитающих. Возбудители векторных заболеваний наносят значительный экономический урон сельскохозяйственным животным [1], а трансмиссивные болезни людей составляют более 17% всех инфекционных болезней, от которых ежегодно умирает более 700 тыс человек [2]. Патогены рода Orbivirus семейства Reoviridae, относящиеся к группе арбовирусов, включают как ряд вирусов, вызывающих респираторные, лихорадочные и неврологические болезни человека с явлениями поражения центральной нервной системы [3], так и важных в эпидемическом отношении возбудителей болезней сельскохозяйственных животных: блютанга (BTV), африканской чумы лошадей (AHSV, АЧЛ), эпизоотической геморрагической болезни оленей (EHDV, ЭГБО), перуанской чумы лошадей (PHSV), которые передаются насекомыми-гематофагами [4–6].

Риск возникновения вспышек трансмиссивных болезней определяется наличием природных резервуаров патогена и векторных переносчиков возбудителей.

Установлено, что летучие мыши являются одним из важных природных резервуаров вирусов многих семейств [7], таких как Filoviridae [8], Coronaviridae [9, 10], Rhabdoviridae [11], Herpesviridae, Adenoviridae [12], Paramyxoviridae [13], Astroviridae и [14] а также Reoviridae, включая род Orbivirus [15, 16].

В европейских странах обитает более 40 видов летучих мышей, которые являются насекомоядными. Они питаются мухами, комарами, мокрецами, многие из которых рассматриваются потенциальными векторами возбудителей особо опасных вирусных болезней животных [17]. Установлено, что одна летучая мышь массой 40 г в течение часа охоты съедает от 200 до 600 насекомых, что составляет до 30 г корма [18].

L.C. La Motte Jr [19] продемонстрировал, что летучие мыши могут заражаться вирусом японского энцефалита, входящим в экологическую группу арбовирусов, при скармливании им инфицированных комаров, и в эксперименте воспроизвёл передачу вируса в цикле «комары – летучие мыши комары». Также эти исследования показали чувствительность к вирусу летучих мышей видов Eptesicus fuscus, Myotis lucifugus Pipistrellus subflavus и способность инфицированных животных поддерживать латентный вирус в условиях имитации гибернации в течение 107 дней.

Приведённые данные позволяют рассматривать насекомоядных летучих мышей как вероятную экологическую нишу и резервуар прежде всего возбудителей арбовирусных инфекций.

Передача патогенов от летучих мышей к млекопитающим может происходить при прямом контакте с животными, через контаминированные секретами и экскретами летучих мышей кормовые продукты (плоды, растения) и иные объекты (места пребывания) или через переносчиков [20, 21]. Распространение вируса летучими мышами возможно с заражением промежуточных хозяев [22].

В то же время отмечены значительные трудности в выделении вирусов от летучих мышей в культурах клеток [23–25]. Для изоляции вирусных патогенов от представителей различных семейств млекопитающих более эффективны культуры клеток, полученные из тканей, содержащих клетки-мишени, в видовом отношении соответствующие носителю вируса.

Первичные и перевиваемые культуры клеток из тканей летучих мышей получены в основном от видов, обитающих в тропических и субтропических зонах всех континентов, а их чувствительность изучена к вирусам зоонозных инфекций человека [26, 27]. Ранее нами показана пермиссивность штамма диплоидных клеток почки лесного нетопыря к вирусам различных таксономических групп – возбудителям болезней животных [28].

Вспышки трансмиссивных заболеваний животных – блютанга, ЭГБО, АЧЛ, относящихся к роду Orbivirus, основным переносчиком возбудителей которых являются мокрецы из рода Culicoides, а также комары, москиты и некоторые виды клещей, – за последние три года регистрировались в странах Европы (Швейцария, Испания, Португалия, Италия, Германия, Франция, Бельгия, Сербия, Румыния, Северная Македония, Люксембург, Греция, Хорватия, Болгария, Босния и Герцеговина, Албания, Черногория), Азии (Израиль) и Африки (Тунис, Эфиопия, Алжир) [29].

Совпадение ареалов распространения и миграции нетопыря-карлика и территорий, неблагополучных по приведённым выше векторным болезням животных, определяют актуальность цели наших исследований – получение диплоидных штаммов клеток лёгкого летучих мышей вида Pipistrellus pipistrellus и изучение их пермиссивности к ряду вирусов рода Orbivirus возбудителей трансмиссивных вирусных заболеваний животных.

Материалы и методы

Животные. В качестве доноров лёгкого отобраны клинически здоровые летучие мыши вида нетопырь-карлик (Pipistrellus pipistrellus), отловленные при помощи туман-сети в августе в Ростовской области.

Культуры клеток. В работе использовали полученные штаммы диплоидных культур клеток лёгкого нетопыря-карлика diploid cell line Pipistrellus pipistrellus lung ep. и diploid cell line Pipistrellus pipistrellus lung f., а также референтные перевиваемые линии клеток почки африканской зелёной мартышки Vero и CV-1 из коллекции клеточных культур Федерального исследовательского центра вирусологии и микробиологии (ФГБНУ ФИЦВиМ, п. Вольгинский) [30].

Вирусы. Пермиссивность клеточных культур определяли к следующим вирусам семейства Reoviridae рода Orbivirus:

  • вирус блютанга 1-го серотипа с инфекционной активностью (ИА) в перевиваемой линии клеток почки африканской зелёной мартышки Vero 6,25 lg ТЦД50/см3;
  • вирус ЭГБО, штамм Альберто с ИА 6,25 ± 0,25 lg ТЦД50/см3 в перевиваемой линии клеток почки африканской зелёной мартышки CV-1;
  • вирус АЧЛ 1-го серотипа на уровне 5-го пассажа в перевиваемой линии клеток CV-1 с ИА 5,75 lg ТЦД50/см3.

Используемые штаммы вирусов получали из Государственной коллекции микроорганизмов, вызывающих опасные, особо опасные, в том числе зооантропонозные и не встречающиеся на территории страны болезни животных (реестровый номер центра коллективного пользования – 441429)1.

Питательные среды и растворы. Среды Игла МЕМ (Minimum Essential Medium), Dulbecco’s MEM (DMEM), DMEM/F12 (1 : 1), McCoy’s 5А, приготовленные из сухих концентратов производства HyClone и Sigma (США). Фетальная сыворотка крови крупного рогатого скота (КРС) производства HyClone (США) и Biological Industry (Израиль). Забуференный фосфатом физиологический раствор (рН 7,4), солевой раствор Эрла, дистиллированная вода, 0,25% раствор трипсина, 0,02% раствор Версена, диметилсульфоксид (Sigma, США).

Первичную культуру клеток готовили методом стандартной трипсинизации ткани в растворе 0,25% трипсина и 0,02% Версена в соотношении 1 : 1 при температуре 35–370С. Субкультивирование культур клеток и установление штаммов диплоидных клеток проводили методом последовательных пересевов.

Кариологическое изучение полученных культур клеток проводили по методике, предложенной C.E. Ford, J.L. Hamerton [31] и K.H. Rothfels, L. Siminovitch 32]. Препараты исследовали при помощи световой микроскопии, проводя подсчёт числа хромосом в метафазных пластинках в 50 клетках каждой культуры.

Чувствительность культур клеток лёгкого летучих мышей к вирусам трансмиссивных инфекционных болезней животных, относящиеся к семейству Reoviridae, оценивали по скорости и интенсивности развития цитопатического действия (ЦПД) в первом пассаже с определением ИА полученного вирусного материала в перевиваемых линиях клеток, к которым данные патогены были адаптированы ранее. Определение пермиссивности полученных клеток к исследуемым вирусам проводили с использованием множественности заражения 0,01–0,001 ТЦД50/кл, адсорбции вируса в течение 60 мин и инкубировании инфицированных культур при 37,0 ± 0,5°C до развития выраженного ЦПД.

ИА вируса определяли путём титрования в пермиссивных для каждого вируса референтных культурах клеток, учитывали развитие ЦПД. Титр вируса рассчитывали по методике Рида и Менча в модификации Ашмарина.

Результаты

Эвтаназию летучих мышей вида Pipistrellus pipistrellus (рис. 1) проводили внутрибрюшинным введением 500 мкл 70% этилового спирта и цервикальной дислокацией шейных позвонков [33]. Данная процедура соответствует российскому законодательству и одобрена Комиссией по биоэтике ФГБНУ ФИЦВиМ как отвечающая требованиям Директивы Европейского Парламента 2010/63/EU [34].

 

Рис. 1. Летучая мышь вида нетопырь-карлик (Pipistrellus pipistrellus).

Fig. 1. The dwarf bat (Pipistrellus pipistrellus).

 

Летучих мышей вскрывали и извлекали лёгкие, которые помещали в ёмкости с солевым раствором Эрла с добавлением антибиотиков (20 мкг/мл ципрофлоксацина и 5 мкг/мл амфотерицина В). Ткань лёгких механически измельчали на фрагменты размером около 2—3 мм3, отмывали от крови солевым раствором Эрла и проводили стандартную трипсинизацию. Объединенную клеточную суспензию центрифугировали при 700 g в течение 10 мин, затем диспергирующую смесь декантировали, осадок клеток ресуспендировали в 25 см3 ростовой среды. При посевной концетрации 375 ± 25 тыс. клеток/см3 и жизнеспособности клеток по тесту витального окрашивания трипановым синим на уровне 82—84% формирование конфлюэнтного монослоя клеток отмечено на 6-е сутки культивирования (рис. 2).

 

Рис. 2. Первично-трипсинизированная культура клеток лёгкого летучей мыши Pipistrellus pipistrellus через 144 ч культивирования (микрофотография, увеличение ×100).

Fig. 2. Primary trypsinized cell culture of Pipistrellus pipistrellus lung after 144 hs of cultivation (microphotograph, magnification ×100).

 

Последовательные пассажи клеточной культуры с коэффициентом пересева 1 : 2 осуществляли с использованием питательной среды DMEM с добавлением 10% фетальной сыворотки крови КРС. При посевной концентрации 135 ± 15 тыс. клеток/см3 конфлюэнтный монослой формировался на 3–5-е сутки культивирования. Субкультура клеток лёгкого была представлена фибробластоподобными клеточными элементами, содержащими ядра овальной формы с 13 округлыми ядрышками, варьирующими по размеру. Ядерный матрикс гомогенный. В монослойной культуре присутствовали в незначительном количестве эпителиоподобные клетки, формирующие отдельные островки роста. Пролиферативная активность клеток с увеличением пассажного уровня возрастала, культура уплотнялась, формировала разнонаправленные потоки.

При пересеве культуры отмечено, что при обработке клеточного монослоя смесью трипсина и Версена 1 : 3 в первую очередь отслаивались фибробластоподобные клетки. Для снятия эпителиоподобных клеток требовалась их более продолжительная экспозиция в диспергирующем растворе. Также пролиферативный потенциал фибробластоподобных клеток был более высокий, что приводило к значительному увеличению их доли в пассажных уровнях. В связи с этим селекцией по адгезивным и ростовым свойствам с использованием низких посевных концентраций культура клеток лёгочной ткани нетопыря-карлика на уровне 27-го пассажа была разделена на две клеточные субпопуляции, отличающиеся по фенотипу: фибробластоподобные и эпителиоподобные. В дальнейшем две эти популяции сохраняли данные цитоморфологические характеристики до начала периода старения (рис. 3).

 

Рис. 3. Монослой культуры клеток лёгкого Pipistrellus pipistrellus: а – диплоидный штамм культуры, 15-й пассаж; б – смешенная культура, 27-й пассаж; в – диплоидный штамм культуры клеток фибробластоподобного типа, 32-й пассаж; г – диплоидный штамм культуры клеток эпителиоподобного типа, 32-й пассаж (микрофотография, увеличение ×150).

Fig. 3. Monolayer of cell culture of Pipistrellus pipistrellus lung: a – diploid culture strain, 15th passage level; b – mixed culture, 27th passage level; c – diploid cell culture strain of fibroblast-like type, 32th passage level; d – diploid cell culture strain of epithelial-like type, 32th passage level (microphotograph, magnification ×150).

 

Кариологический анализ клеток лёгкого нетопыря-карлика на уровне 33-го пассажа подтвердил видовую принадлежность полученных культур. В условиях непрерывного культивирования обе культуры показали стабильность кариотипа, который сохранял как диплоидный набор хромосом (2n = 42, NFа = 50), так и отсутствие хромосомных перестроек и образование маркерных хромосом (рис. 4).

 

Рис. 4. Метафазные пластинки культуры клеток лёгкого Pipistrellus pipistrellus: а – эпителиоподобных клеток; б – фибробластоподобных клеток (микрофотография, увеличение ×900).

Fig. 4. Metaphase plate of the cell culture of Pipistrellus pipistrellus lung: a – epithelial-like cells; b – fibroblast-like cells (microphotograph, magnification ×900).

 

Оптимизация среды культивирования клеток лёгкого нетопыря-карлика показала, что среды DMEM/F12 и McCoy’s обеспечивали более высокие пролиферативные показатели культуры при равной цитоморфологической картине монослоя. При этом срок формирования конфлюэнтного монослоя и индекс пролиферации у них были выше, чем в среде DMEM. Для дальнейшего использования была выбрана среда DMEM/F12.

По совокупности цитоморфологических, ростовых и кариологических показателей клеточные культуры P. pipistrellus lung f. и P. pipistrellus lung ep. соответствовали определению диплоидного штамма и получили наименования «Штамм диплоидных эпителиоподобных клеток лёгкого нетопыря-карлика (Diploid cell line Pipistrellus pipistrellus lung ep.)» и «Штамм диплоидных фибробластоподобных клеток лёгкого нетопыря-карлика (Diploid cell line Pipistrellus pipistrellus lung f.)» соответственно. Полученные культуры клеток криоконсервированы в жидком азоте на различных пассажных уровнях. Жизнеспособность данных культур клеток после размораживания по тесту витального окрашивания трипановым синим составила 74–92%.

Во второй фазе (активной пролиферации) диплоидные штаммы клеток находились до уровня 43-го пассажа культуры фибробластоподобного типа и до 47-го пассажного уровня культуры эпителиоподобного типа. При коэффициентах пересева 1 : 2–1 : 3 в оптимизированной среде (DMEM/F12 90% и FBS 10%) клетки формировали конфлюэнтный монослой через 48 ч культивирования. Отмечено, что культура фибробластоподобного типа сохраняла без смены среды типичную морфологию и отсутствие проявлений цитопатического эффекта, вызванного возможными эндогенными вирусами, и признаков дегенерации клеток в течение 28 дней, а культура эпителиоподобного типа сохраняла те же характеристики в течение 35 дней.

Бактериологический контроль клеточных расплодок обеих культур показал отсутствие контаминации бактериями, грибами и микоплазмами. Возможные экзогенные вирусные контаминанты (пестивирусы диареи КРС и классической чумы свиней), источником которых могут быть сыворотки крови и трипсин, методом полимеразной цепной реакции в режиме реального времени не выявлены.

При изучении пермиссивности штаммов диплоидных клеток лёгкого летучих мышей к вирусу блютанга 1-го серотипа на 2-е сутки отмечены начальные признаки ЦПД в культуре клеток diploid cell line P. pipistrellus lung ep. в виде округления клеток. На 3-и сутки в культуре наблюдали отслоение и лизис инфицированных клеток, сопровождающийся деструкцией клеточного монослоя.

В культуре diploid cell line P. pipistrellus lung f. ЦПД вируса проявлялось на 6-е сутки с округлением клеток, разрежением монослоя и отслоением клеток. В контрольных интактных (неинфицированных) культурах изменений клеточного монослоя не наблюдали.

Результаты определения ИА вируса блютанга, полученного в культуре клеток diploid cell line P. pipistrellus lung ep., сопоставимы с активностью вируса в контрольной культуре инфицированных пермиссивных клеток почки африканской зелёной мартышки (Vero), в которой отмечено развитие характерного ЦПД с активностью вируса 6,31 ± 0,14 lg ТЦД50/см3.

Вирусрепродуцирующая активность diploid cell line P. pipistrellus lung f. в отношении вируса блютанга была на два логарифма ниже, и срок развития ЦПД также отставал.

Характер развития ЦПД вируса блютанга в штаммах диплоидных клеток лёгкого Pipistrellus pipistrellus представлен на рис. 5.

 

Рис. 5. Цитопатическое действие вируса блютанга: а – в культуре diploid cell line P. pipistrellus lung ep., 33-й пассаж, на 3-и сутки; б – контроль diploid cell line P. pipistrellus lung ep., 33-й пассаж; в – в культуре diploid cell line P. pipistrellus lung f., 32-й пассаж, на 6-е сутки; г – контроль diploid cell line P. pipistrellus lung f., 32-й пассаж (микрофотография, увеличение ×150).

Fig. 5. Cytopathic effect of BTV: a – in the culture of diploid cell line P. pipistrellus lung ep., 33th passage level, on the third day; b – control diploid cell line P. pipistrellus lung ep., 33th passage level; c – in the culture of diploid cell line P. pipistrellus lung f., 32th passage level, sixth day; d – diploid cell line control P. pipistrellus lung f., 32th passage level (microphotograph, magnification ×150).

 

При изучении чувствительности культур исследуемых штаммов диплоидных клеток к вирусу ЭГБО на 2-е сутки в культурах клетках diploid cell line P. pipistrellus lung ep. и diploid cell line P. pipistrellus lung f. отмечен лизис отдельных клеток монослоя. ЦПД вируса в diploid cell line P. pipistrellus lung ep. выражалось в очаговой деструкции и отслоении клеток на 3-й день, а в культуре клеток diploid cell line P. pipistrellus lung f. на 4-й день после заражения. Характер развития ЦПД вируса ЭГБО в штаммах диплоидных клеток лёгкого летучих мышей представлен на рис. 6.

 

Рис. 6. Цитопатическое действие вируса эпизоотической геморрагической болезни оленей: а – в культуре diploid cell line P. pipistrellus lung ep., 33-й пассаж, на 2-е сутки; б – контроль diploid cell line P. pipistrellus lung ep., 33-й пассаж, в – в культуре diploid cell line P. pipistrellus lung f., 32-й пассаж, на 3-и сутки; г – контроль diploid cell line P. pipistrellus lung f., 32-й пассаж (микрофотография, увеличение ×150).

Fig. 6. Cytopathic effect of EHDV: a – in the culture of diploid cell line P. pipistrellus lung ep., 33th passage level, on the second day; b – control diploid cell line P. pipistrellus lung ep., 33th passage level; c – in the culture of diploid cell line P. pipistrellus lung f., 32th passage level, on the third day; d – diploid cell line control P. pipistrellus lung f., 32th passage level (microphotograph, magnification ×150).

 

В контрольной культуре инфицированных референтных пермиссивных клеток CV-1 отмечено развитие характерного ЦПД с накоплением вируса до титров ИА 6,38 ± 0,08 lg ТЦД50/см3, тогда как в diploid cell line P. pipistrellus lung ep. она составила 5,69 ± 0,22 lg ТЦД50/см3, а в diploid cell line P. pipistrellus lung f. она была ниже 4,56 ± 0,07 lg ТЦД50/см3 и ЦПД развивалось на сутки позже.

Это указывает на то, что культуры клеток одного тканевого происхождения (лёгочная ткань), но представленные разным фенотипом клеток (эпителиоподобные и фибробластоподобные), обладали различной пермиссивностью к исследуемому вирусу.

Изучение чувствительности штаммов диплоидных клеток к вирусу АЧЛ показало, что развитие ЦПД вируса в культуре клеток diploid cell line P. pipistrellus lung f. проявлялось на 1-е сутки в виде лизиса клеток и разрежение монослоя. В культуре клеток diploid cell line P. pipistrellus lung ep. цитопатический эффект вируса АЧЛ, сопровождающийся округлением и отслоением инфицированных клеток от подложки с деструкцией клеточного монослоя, отмечали через 72 ч (рис. 7).

 

Рис. 7. Цитопатическое действие вируса африканской чумы лошадей: а – в культуре diploid cell line P. pipistrellus lung ep., 32-й пассаж, на 3-и сутки; б – контроль diploid cell line P. pipistrellus lung ep., 32-й пассаж; в – в культуре diploid cell line P. pipistrellus lung f., 32-й пассаж, на 3-и сутки; г – контроль diploid cell line P. pipistrellus lung f., 32-й пассаж (микрофотография, увеличение ×150).

Fig. 7. Cytopathic effect of African horse sickness virus: a – in the culture of diploid cell line P. pipistrellus lung ep., 32th passage level, on the third day; b – control diploid cell line P. pipistrellus lung ep., 32th passage level; c – in the culture of diploid cell line P. pipistrellus lung f., 32th passage level, for the first day; d – diploid cell line control P. pipistrellus lung f., 32th passage level (microphotograph, magnification ×150).

 

ИА вирусного материала, полученного в diploid cell line P. pipistrellus lung ep., при титровании в пермиссивной культуре клеток CV-1 составила 5,75 ± 0,18 lg ТЦД50/см3. Фибробластоподобная культура клеток лёгкого была более пермиссивна к вирусу, в которой он накапливался на 1,52 логарифма выше (7,25 ± 0,17 lg ТЦД50/см3), а ЦПД развивалось в течение 24 ч после инокуляции вируса. В контрольной культуре инфицированных пермиссивных клеток CV-1 активность вируса составляла 5,69 ± 0,14 lg ТЦД50/см3 (таблица).

 

Таблица. Оценка пермиссивности штаммов диплоидных культур клеток лёгкого нетопыря-карлика к реовирусам (n = 4)

Table. Sensitivity of the diploid cell line P. pipistrellus lung to viruses of the Reoviridae family (n = 4)

№

Вирус, семейство

Virus, family

Сроки ЦПД (сутки) / Инфекционная активность в культурах клеток (lg ТЦД50/см3)

Time frame of cytopathic action (day) / Infection activity in cell culture (lg TCID50/ml3)

diploid cell line P. pipistrellus lung ep.

diploid cell line P. pipistrellus lung f.

контрольная (референтная) культура клеток

control (reference) cell culture

1

Блютанг, Reoviridae

Bluetongue, Reoviridae

3 / 6,06 ± 0,18

6 / 4,06 ± 0,14

6,0–6,5 (Vero)

2

ЭГБО, Reoviridae

EHD, Reoviridae

2 / 5,69 ± 0,22

3 / 4,56 ± 0,07

3 / 6,0–6,5 (CV-1)

3

АЧЛ, Reoviridae

AHS, Reoviridae

3 / 5,75 ± 0,18

1 / 7,25 ± 0,17

3 / 5,5–6,0 (CV-1)

Примечание. АЧЛ – африканская чума лошадей, ЭГБО – эпизоотическая геморрагическая болезнь оленей, ЦПД – цитопатическое действие.

Note. AHS – African horse sickness, EHD – epizootic hemorrhagic disease of deer, TCID – tissue culture infectious dose.

 

Обсуждение

Арбовирусные инфекции, включая болезни сельскохозяйственных животных, вызываемые представителями рода Orbivirus, представляют постоянный риск заноса и распространения. Идентификация реовирусов и новых патогенов этого семейства у летучих мышей свидетельствует о высоком уровне пермиссивности клеток тканей и органов представителей Microchiroptera [35].

Роль летучих мышей, обитающих и мигрирующих в Российской Федерации с включением в ареал распространения территории сопредельных стран, неблагополучных по трансмиссивным болезням млекопитающих, недостаточно изучена. Культуры клеток из тканей летучих мышей являются наиболее востребованной лабораторной моделью для первичной изоляции и изучения вирусов, ассоциированных с отрядом рукокрылых. Полученные нами штаммы диплоидных клеток лёгкого нетопыря-карлика Pipistrellus pipistrellus обладали стабильными цитоморфологическими, пролиферативными и кариологическими характеристиками, что позволило создать крупные криобанки клеток для проведения долговременных вирусологических исследований.

Результаты исследований показали репродукцию орбивирусов возбудителей трансмиссивных инфекций сельскохозяйственных животных с развитием цитопатического эффекта в клетках полученных штаммов диплоидных клеток лёгкого летучих мышей вида нетопырь-карлик без предварительной адаптации вирусов к клеткам. ИА вируса АЧЛ в фибробластоподных клетках значительно превышала активность как в культуре клеток лёгкого эпителиоподобного типа, так и в перевиваемой линии клеток CV-1, к которой данный штамм вируса был адаптирован ранее. Данные по пермиссивности клеток из тканей представителей отряда рукокрылых к орбивирусам позволяют рассматривать вид Pipistrellus pipistrellus как возможный природный резервуар этих патогенов и его непосредственное участие в эпидемическом процессе.

Выводы

  1. Впервые получены и паспортизированы штаммы диплоидных клеток из тканей лёгкого нетопыря-карлика P. pipistrellus lung f. и P. pipistrellus lung ep. Созданы криобанки клеточных штаммов на разных пассажных уровнях для вирусологических исследований.
  2. Установлена пермиссивность полученных штаммов диплоидных клеток лёгкого нетопыря-карлика к вирусам блютанга, ЭГБО и АЧЛ, что позволяет рекомендовать данные клеточные системы для первичной изоляции вирусных патогенов.
  3. Репродукция вирусов рода Orbivirus возбудителей трансмиссивных болезней сельскохозяйственных животных в культурах клеток лёгкого нетопыря-карлика Pipistrellus pipistrellus указывает на возможность участия представителей данного вида в эпидемическом процессе в качестве переносчика возбудителя или промежуточного хозяина при формировании природных резервуаров инфекции.

Участие авторов: Поволяева О.С. – концепция и дизайн исследования, проведение экспериментов, сбор, анализ и интерпретация данных, подготовка текста; Чадаева А.А. – проведение экспериментов; Луницин А.В. – сбор, анализ и интерпретация данных; Юрков С.Г. – концепция и дизайн исследования, проведение экспериментов, сбор, анализ и интерпретация данных, подготовка текста, окончательное одобрение статьи к публикации.

Финансирование. Работа выполнена в рамках бюджетного финансирования.

Конфликт интересов. Авторы декларируют отсутствие явных и потенциальных конфликтов интересов, связанных с публикацией настоящей статьи.

Этическое утверждение. Авторы подтверждают соблюдение институциональных и национальных стандартов по использованию лабораторных животных в соответствии с Consensus Author Guidelines for Animal Use (IAVES, 23 July 2010). Протокол исследования одобрен этическим комитетом организации (протокол № 7 от 05.08.2020).

 

1 Государственная коллекция микроорганизмов, вызывающих опасные, особо опасные, в том числе зооантропонозные и не встречающиеся на территории страны болезни животных. URL: http://ckp-rf.ru/ckp/441429/

×

Об авторах

Ольга Сергеевна Поволяева

ФГБНУ «Федеральный исследовательский центр вирусологии и микробиологии»

Email: 2741188@mail.ru
ORCID iD: 0000-0002-5635-6677

микробиолог

Россия, 601125, Владимирская обл., п. Вольгинский

Анна Александровна Чадаева

ФГБНУ «Федеральный исследовательский центр вирусологии и микробиологии»

Email: a_doct_or@mail.ru
ORCID iD: 0000-0002-9615-9758

микробиолог

Россия, 601125, Владимирская обл., п. Вольгинский

Андрей Владимирович Луницин

ФГБНУ «Федеральный исследовательский центр вирусологии и микробиологии»

Email: lunicyn@mail.ru
ORCID iD: 0000-0002-5043-446X

старший научный сотрудник, заместитель директора по производству и качеству

Россия, 601125, Владимирская обл., п. Вольгинский

Сергей Григорьевич Юрков

ФГБНУ «Федеральный исследовательский центр вирусологии и микробиологии»

Автор, ответственный за переписку.
Email: patronn13@rambler.ru
ORCID iD: 0000-0002-6801-9424

доктор биологических наук, профессор, главный научный сотрудник

Россия, 601125, Владимирская обл., п. Вольгинский

Список литературы

  1. Narladkar B.W. Projected economic losses due to vector and vector-borne parasitic diseases in livestock of India and its significance in implementing the concept of integrated practices for vector management. Vet. World. 2018; 11(2): 151–60. https://doi.org/10.14202/vetworld.2018.151-160
  2. ВОЗ. Трансмиссивные болезни: Информационный бюллетень; 2020. Available at: https://www.who.int/ru/news-room/fact-sheets/detail/vector-borne-diseases
  3. Еремян А.А., Львов Д.К., Щетинин А.М., Дерябин П.Г., Аристова В.А., Гительман А.К. и др. Генетическое разнообразие вирусов вида Chenuda virus (Orbivirus, Reoviridae), циркулирующих в Средней Азии. Вопросы вирусологии. 2017; 62(2): 81–6. https://doi.org/10.18821/0507-4088-2017-62-2-81-86
  4. Maclachlan N.J., Guthrie A.J. Re-emergence of bluetongue, African horse sickness, and other orbivirus diseases. Vet. Res. 2010; 41(6): 35. https://doi.org/10.1051/vetres/2010007
  5. Львов Д.К., Алексеев К.П., Алимбарова Л.М., Алипер Т.И., Альховский С.В., Андронова В.Л. и др. Вирусы и вирусные инфекции человека и животных. Руководство по вирусологии. М.; МИА; 2013.
  6. Attoui H., Mohd Jaafar F. Zoonotic and emerging orbivirus infections. Rev. Sci. Tech. 2015; 34(2): 353–61. https://doi.org/10.20506/rst.34.2.2362
  7. Calisher C.H., Childs J.E., Field H.E., Holmes K.V., Schountz T. Bats: Important reservoir hosts of emerging viruses. Clin. Microbiol. Rev. 2006; 19(3): 531–45. https://doi.org/10.1128/CMR.00017-06
  8. Leroy E.M., Kumulungui B., Pourrut X., Rouquet P., Hassanin A., Yaba P., et al. Fruit bats as reservoirs of Ebola virus. Nature. 2005; 438(7068): 575–6. https://doi.org/10.1038/438575a
  9. Lau S.K., Woo P.C., Li K.S., Huang Y., Tsoi H.W., Wong B.H., et al. Severe acute respiratory syndrome coronavirus-like virus in Chinese horseshoe bats. Proc. Natl Acad. Sci. USA. 2005; 102(39): 14040–5. https://doi.org/10.1073/pnas.0506735102
  10. Ge X.Y., Li J.L., Yang X.L., Chmura A.A., Zhu G., Epstein J.H., et al. Isolation and characterization of a bat SARS-like coronavirus that uses the ACE2 receptor. Nature. 2013; 7477(503): 535–8. https://doi.org/10.1038/nature12711
  11. Aréchiga Ceballos N., Vázquez Morón S., Berciano J.M., Nicolás O., Aznar López C., Juste J., et al. Novel lyssavirus in bat, Spain. Emerg. Infect. Dis. 2013; 19(5): 793–5. https://doi.org/10.3201/eid1905
  12. Jánoska M., Vidovszky M., Molnár V., Liptovszky M., Harrach B., Benko M. Novel adenoviruses and herpesviruses detected in bats. Vet. J. 2011; 189(1): 118–21. https://doi.org/10.1016/j.tvjl.2010.06.020
  13. Aurine N., Baquerre C., Gaudino M., Jean C., Dumont C., Rival-Gervier S., et al. Reprogrammed Pteropus bat stem cells as a model to study host-pathogen interaction during Henipavirus infection. Microorganisms. 2021; 9(12): 2567. https://doi.org/10.3390/microorganisms9122567
  14. Waruhiu C., Ommeh S., Obanda V., Agwanda B., Gakuya F., Ge X.Y., et al. Molecular detection of viruses in Kenyan bats and discovery of novel astroviruses, caliciviruses and rotaviruses. Virol. Sin. 2017; 32(2): 101–14. https://doi.org/10.1007/s12250-016-3930-2
  15. Kohl C., Lesnik R., Brinkmann A., Ebinger A., Radonić A., Nitsche A., et al. Isolation and characterization of three mammalian orthoreoviruses from European bats. PLoS One. 2012; 7(8): e43106. https://doi.org/10.1371/journal.pone.0043106
  16. Chua K.B., Crameri G., Hyatt A., Yu M., Tompang M.R., Rosli J., et al. A previously unknown reovirus of bat origin is associated with an acute respiratory disease in humans. Proc. Natl Acad. Sci. USA. 2007; 104(27): 11424–9. https://doi.org/10.1073/pnas.0701372104
  17. Макаров В.В., Лозовой Д.А. Новые особо опасные инфекции, ассоциированные с рукокрылыми. Владимир; 2016.
  18. Gonsalves L., Bicknell B., Law B., Webb C., Monamy V. Mosquito consumption by insectivorous bats: does size matter? PLoS One. 2013; 8(10): e77183. https://doi.org/10.1371/journal.pone.0077183
  19. La Motte L.C. Jr. Japanese B encephalitis in bats during simulated hibernation. Am. J. Hyg. 1958; 67(1): 101–8. https://doi.org/10.1093/oxfordjournals.aje.a119912
  20. Melaun C., Werblow A., Busch M.W., Liston A., Klimpel S. Bats as potential reservoir hosts for vector-borne diseases. In: Klimpel S., Mehlhorn H. Bats (Chiroptera) as Vectors of Diseases and Parasites. Parasitology Research Monographs, Volume 5. Berlin, Heidelberg: Springer; 2014. https://doi.org/10.1007/978-3-642-39333-4_3
  21. Schuh A.J., Amman B.R., Jones M.E., Sealy T.K., Uebelhoer L.S., Spengler J.R., et al. Modelling filovirus maintenance in nature by experimental transmission of Marburg virus between Egyptian rousette bats. Nat. Commun. 2017; 8: 14446. https://doi.org/10.1038/ncomms14446
  22. Smith I., Wang L.F. Bats and their virome: an important source of emerging viruses capable of infecting humans. Curr. Opin. Virol. 2013; 3(1): 84–91. https://doi.org/10.1016/j.coviro.2012.11.006
  23. Gloza-Rausch F., Ipsen A., Seebens A., Göttsche M., Panning M., Drexler J.F., et al. Detection and prevalence patterns of group I coronaviruses in bats, northern Germany. Emerg. Infect. Dis. 2008; 14(4): 626–31. https://doi.org/10.3201/eid1404.071439
  24. Geldenhuys M., Coertse J., Mortlock M., Markotter W. In Vitro Isolation of Bat Viruses Using Commercial and Bat-Derived Cell Lines. Caister Academic Press; 2020: 149–80. https://doi.org/10.21775/9781912530144.10
  25. Banerjee A., Misra V., Schountz T., Baker M.L. Tools to study pathogen-host interactions in bats. Virus Res. 2018; 248: 5–12. https://doi.org/10.1016/j.virusres.2018.02.013
  26. Crameri G., Todd S., Grimley S., McEachern J.A., Marsh G.A., Smith C., et al. Establishment, immortalisation and characterisation of pteropid bat cell lines. PLoS One. 2009; 4(12): e8266. https://doi.org/10.1371/journal.pone.0008266
  27. Hoffmann M., Müller M.A., Drexler J.F., Glende J., Erdt M., Gützkow T., et al. Differential sensitivity of bat cells to infection by enveloped RNA viruses: coronaviruses, paramyxoviruses, filoviruses, and influenza viruses. PLoS One. 2013; 8(8): e72942. https://doi.org/10.1371/journal.pone.0072942
  28. Поволяева О.С., Юрков С.Г., Лаптева О.Г., Колбасова О.Л., Чадаева А.А., Кольцов А.Ю. и др. Биологическая характеристика и пермиссивность к вирусам штамма диплоидных клеток почки летучей мыши нетопыря Натузиуса (Pipistrellus nathusii Keyserling & Blasius, 1839; (Chiroptera: Microchiroptera: Vespertilionidae). Вопросы вирусологии. 2021; 66(1): 29–39. https://doi.org/10.36233/0507-4088-12
  29. OIE; World Animal Health Information System. Disease situation. Available at: https://wahis.oie.int/#/dashboards/country-or-disease-dashboard
  30. Юрков С.Г., Зуев В.В., Сидоров С.И., Кушнир С.Д., Смыслова Н.Ю., Неверовская Н.С. и др. Каталог коллекции клеточных культур ВНИИВВиМ. Покров; 2010.
  31. Ford C.E., Hamerton J.L. A colchicine, hypotonic citrate, squash sequence for mammalian chromosomes. Stain Technol. 1956; 31(6): 247–51. https://doi.org/10.3109/10520295609113814
  32. Rothfels K.H., Siminovitch L. Air drying technique for flattening chromosomes in mammalian cells grown in vitro. Stain Technol. 1958; 33(2): 73–7. https://doi.org/10.3109/10520295809111827
  33. Baker K.S., Todd S., Marsh G., Fernandez-Loras A., Suu-Ire R., Wood J.L.N., et al. Co-circulation of diverse paramyxoviruses in an urban African fruit bat population. J. Gen. Virol. 2012; 93(Pt. 4): 850–6. https://doi.org/10.1099/vir.0.039339-0
  34. Directive 2010/63/EU of the European parliament and of the Council of 22 September 2010 on the protection of animals used for scientific purposes. Available at: https://eur-lex.europa.eu/legal-content/EN/TXT/?uri=CELEX%3A32010L0063
  35. Fagre A.C., Lee J.S., Kityo R.M., Bergren N.A., Mossel E.C., Nakayiki T., et al. Discovery and characterization of Bukakata orbivirus (Reoviridae:Orbivirus), a novel virus from a Ugandan bat. Viruses. 2019; 11(3): 209. https://doi.org/10.3390/v11030209

Дополнительные файлы

Доп. файлы
Действие
1. JATS XML
Скачать
2. Рис. 1. Летучая мышь вида нетопырь-карлик (Pipistrellus pipistrellus).

Скачать (159KB)
Метаданные
3. Рис. 2. Первично-трипсинизированная культура клеток лёгкого летучей мыши Pipistrellus pipistrellus через 144 ч культивирования (микрофотография, увеличение ×100).

Скачать (113KB)
Метаданные
4. Рис. 3. Монослой культуры клеток лёгкого Pipistrellus pipistrellus: а – диплоидный штамм культуры, 15-й пассаж; б – смешенная культура, 27-й пассаж; в – диплоидный штамм культуры клеток фибробластоподобного типа, 32-й пассаж; г – диплоидный штамм культуры клеток эпителиоподобного типа, 32-й пассаж (микрофотография, увеличение ×150).

Скачать (308KB)
Метаданные
5. Рис. 4. Метафазные пластинки культуры клеток лёгкого Pipistrellus pipistrellus: а – эпителиоподобных клеток; б – фибробластоподобных клеток (микрофотография, увеличение ×900).

Скачать (218KB)
Метаданные
6. Рис. 5. Цитопатическое действие вируса блютанга: а – в культуре diploid cell line P. pipistrellus lung ep., 33-й пассаж, на 3-и сутки; б – контроль diploid cell line P. pipistrellus lung ep., 33-й пассаж; в – в культуре diploid cell line P. pipistrellus lung f., 32-й пассаж, на 6-е сутки; г – контроль diploid cell line P. pipistrellus lung f., 32-й пассаж (микрофотография, увеличение ×150).

Скачать (199KB)
Метаданные
7. Рис. 6. Цитопатическое действие вируса эпизоотической геморрагической болезни оленей: а – в культуре diploid cell line P. pipistrellus lung ep., 33-й пассаж, на 2-е сутки; б – контроль diploid cell line P. pipistrellus lung ep., 33-й пассаж, в – в культуре diploid cell line P. pipistrellus lung f., 32-й пассаж, на 3-и сутки; г – контроль diploid cell line P. pipistrellus lung f., 32-й пассаж (микрофотография, увеличение ×150).

Скачать (197KB)
Метаданные
8. Рис. 7. Цитопатическое действие вируса африканской чумы лошадей: а – в культуре diploid cell line P. pipistrellus lung ep., 32-й пассаж, на 3-и сутки; б – контроль diploid cell line P. pipistrellus lung ep., 32-й пассаж; в – в культуре diploid cell line P. pipistrellus lung f., 32-й пассаж, на 3-и сутки; г – контроль diploid cell line P. pipistrellus lung f., 32-й пассаж (микрофотография, увеличение ×150).

Скачать (286KB)
Метаданные

© Поволяева О.С., Чадаева А.А., Луницин А.В., Юрков С.Г., 2022

Creative Commons License
Эта статья доступна по лицензии Creative Commons Attribution 4.0 International License.
СМИ зарегистрировано Федеральной службой по надзору в сфере связи, информационных технологий и массовых коммуникаций (Роскомнадзор).
Регистрационный номер и дата принятия решения о регистрации СМИ: серия ПИ № ФС77-77676 от 29.01.2020.


Данный сайт использует cookie-файлы

Продолжая использовать наш сайт, вы даете согласие на обработку файлов cookie, которые обеспечивают правильную работу сайта.

О куки-файлах