Иммуноферментная идентификация escape-мутантов S143L и G145R вируса гепатита B (Hepadnaviridae: Orthohepadnavirus: Hepatitis B virus)

Полный текст

Введение

Среди множества заболеваний, вызываемых вирусами у человека, лишь немногие обладают столь глобальной общественной значимостью, как вирусный гепатит В. Вирусом гепатита В (Hepadnaviridae: Orthohepadnavirus: Hepatitis B virus) (ВГВ) инфицирована примерно ⅓ населения планеты, при этом хроническая форма инфекции зарегистрирована не менее чем у 360 млн человек. Из-за клинических осложнений болезни, таких как цирроз печени и гепатоцеллюлярная карцинома, в мире происходит около 1 млн смертей в год [1]. В 2016 г. 69-я Всемирная ассамблея здравоохранения одобрила Глобальную стратегию сектора здравоохранения по вирусному гепатиту, целью которой определена ликвидация инфекционного гепатита как угрозы общественному здоровью к 2030 г. Установлены следующие рекомендуемые целевые показатели: снижение распространённости ВГВ среди детей в возрасте 1 года до ≤0,1%; снижение смертности от гепатита В до ≤5 на 100 тыс. населения; ежегодное снижение числа новых случаев коинфекции ВГВ и вируса гепатита С (Flaviviridae: Hepacivirus: Hepatitis С virus) [2].

Тем не менее распространение ВГВ продолжается, несмотря на проводимую во многих странах широкомасштабную вакцинацию против гепатита В, а также осуществление других противоэпидемических мероприятий. Такая ситуация во многом обусловлена разнообразными механизмами, сформировавшимися в ходе эволюции вируса и способствующими его выживанию в условиях иммунологического прессинга [3]. Существенное значение в этом отношении имеет возникновение мутантов диагностического, иммунологического и вакцинального ускользания (англ. escape) (escape-мутантов), которые выявляются во всём мире [4]. Вакцины, созданные на основе поверхностного антигена (HBsAg) вируса дикого типа, защищают не от всех escape-мутантов [5].

Процесс распространения подобных мутантов, по-видимому, происходит неравномерно, что зависит, прежде всего, от генотипа возбудителя [4][6]. Кроме того, escape-мутации преимущественно накапливаются у лиц определённых категорий, то есть в особых группах риска. В частности, наибольшая встречаемость мутантов продемонстрирована у онкогематологических больных [7][8], вакцинированных детей [7], а также у получивших иммунопрофилактику детей, рождённых от матерей – носителей вируса [10].

Проникновение escape-мутантов в популяции (в т.ч. охарактеризованные выше) напрямую связано также с ошибками обнаружения этих видоизменённых вариантов вируса [11]. Аналитическая чувствительность тестирования на HBsAg зависит от генотипа или субтипа ВГВ, но в случае escape-мутаций ситуация гораздо более сложная и неоднозначная. Исследования показали, что мутации в S-гене ВГВ, расположенные вблизи а-детерминанты HBsAg или в регуляторных элементах, могут существенным образом влиять на антигенные профили HBsAg, приводя иногда к полному нарушению распознавания последнего моноклональными антителами (АТ) диагностических тест-систем [11][12]. Даже наиболее чувствительная на сегодняшний день количественная хемилюминесцентная тест-система «Lumipulse HBsAg-HQ» (Fujirebio Inc., Япония), которая имеет по отношению к ВГВ дикого типа диагностическую чувствительность 0,005 МЕ/мл (с нижним порогом детекции ~0,0011 МЕ/мл), обеспечивает существенно худшее качество выявления рекомбинантных HBsAg с escape-мутациями по сравнению с диким типом этого антигена [12]. В то же время в целях адекватной оценки чувствительности подобных тест-систем в отношении escape-мутантов желательно использовать сывороточные панели с природными мутантами, так как серологический портрет мутантного HBsAg естественного происхождения может не совпадать с таковым его рекомбинантного варианта [13]. Помимо этого, возможно снижение чувствительности диагностической тест-системы на фоне присутствия множественных escape-мутаций в HBsAg. В итоге недостаточно тщательная оценка способности тест-системы к обнаружению escape-мутантов может иметь результатом их недовыявление.

В настоящее время не существует рутинных диагностических тестов для определения мутантов подобного рода. Наиболее эффективным и надёжным способом является секвенирование нового поколения (next generation sequencing, NGS) [7], однако на сегодняшний день это достаточно трудоёмкая и дорогая методика. Разрабатывались решения на основе методов полимеразной цепной реакции (polymerase chain reaction, PCR) и гэп-лигазной цепной реакции (gap ligase chain reaction, g-LCR), например для детекции escape-мутантов D144A [14] и G145R [15][16]. Кроме того, известны попытки применения ПЦР предельного разведения (limiting dilution cloning PCR, LDC-PCR) в сочетании с секвенированием для выявления escape-мутаций в 120, 126, 128, 133, 141–145 а.о. [17][18]. Были также разработаны микрочипы для ДНК-идентификации генотипов ВГВ и выявления важных мутаций в генах S, Pol, Core и X [19]. Однако все эти исследования не привели к разработке полноценных диагностических тест-систем. Ранее мы предлагали алгоритм серологического поиска мутаций в 143 и 145 а.о. HBsAg в сыворотке крови (S-HBsAg), основанный на серологическом портретировании – иммуноферментном выявлении дефектов взаимодействия данного антигена с моноклональными анти-HBsAg АТ по критерию падения чувствительности иммуноферментного анализа (ИФА) в ≥10 раз при серийных 10-кратных разведениях сывороток [20]. Однако этот вариант оказался довольно трудоёмким, поскольку предполагал использование 11 моноклональных конъюгатов.

Целью данной работы стала оценка чувствительности и специфичности метода серологического портретирования, адаптированного для рутинного выявления escape-мутаций в 143 и 145 а.о. S-HBsAg.

Материал и методы

Образцы. Исследование проводили на 56 образцах сывороток крови, которые были получены от пациентов различных стационаров и донорских пунктов Российской Федерации. На основании данных анамнеза или источника получения образцов пациентов разделили на следующие группы: доноры (n = 11), хронические носители HBsAg (группа «Носители») (n = 8) и страдающие злокачественными заболеваниями крови (группа «Онкогематология») (n = 37).

Образцы сывороток исследовали на наличие серологических маркёров возбудителя гепатита В (HBsAg, АТ анти-HBs, антиген инфекционности HBeAg, анти-HBe IgG, анти-HBc IgM + IgG). Кроме того, в пробах определяли уровень вирусной нагрузки ВГВ. Анализ escape-мутаций в положениях 143 и 145 а.о. проводили методами NGS и ИФА посредством иммуноферментной тест-системы «Гепастрип-мутант-3К». Сыворотки проверяли также на АТ к вирусам гепатитов С и D.

Диагностические наборы. Исследование сывороток крови на наличие HBsAg проводили с использованием иммуноферментной тест-системы «Гепастрип В» (ООО «Ниармедик Плюс», Россия). Для ряда образцов определяли количество HBsAg, используя отраслевой стандарт (ОСО) HBsAg 42-28-311-00 (ООО «НПО «Диагностические системы», Россия). Тестирование на другие маркёры инфицирования ВГВ, а также на наличие суммарных антител к вирусам гепатитов С и D выполняли методом ИФА с использованием тест-систем производства ЗАО «Вектор-Бест» (Россия): «ВектоHBe-IgG» (кат. № D-0578), «ВектоHBe антиген» (кат. № D-0576), «Векто-HBc антитела» (кат. № D-0566), «Векто-HBsAg антитела» (кат. № D-0562), «Бест анти-ВГС» (комплект 3) (кат. № D-0773) и «Вектогеп D-антитела» (кат. № D-0954). ИФА проводили в соответствии с прилагаемыми инструкциями производителя.

Выделение и количественное определение ДНК ВГВ осуществляли методом ПЦР в реальном времени (ПЦР-РВ) с помощью набора реагентов «РеалБест ДНК ВГВ» (количественный вариант) (кат. № D-0599, ЗАО «Вектор-Бест», Россия) также согласно инструкции производителя.

Моноклональные конъюгаты. Моноклональные мышиные АТ к HBsAg (11F3, H2), а также их конъюгаты с пероксидазой хрена, приготовленные по методу P. Tijssen и соавт. [21], получены в лаборатории медиаторов и эффекторов иммунитета ФГБУ «Национальный исследовательский центр эпидемиологии и микробиологии имени почётного академика Н.Ф. Гамалеи» (НИЦЭМ) Минздрава России. Кроме того, использовали коммерчески доступный конъюгат NF5 (ООО «Сорбент», Россия).

Полногеномное глубокое секвенирование изолятов вируса гепатита В. Полногеномное исследование методом NGS проводили для всех 56 изолятов. С целью амплификации образцов ДНК использовали праймеры, расположенные в консервативных участках генома, с учётом перекрытия амплифицируемых локусов. Каждую реакцию амплификации осуществляли отдельно. В реакции использовали следующие праймеры [22][23]:
– пара 1: 1-TCACCATATTCTTGGGAACAAGA,
– 2-CGAACCACTGAACAAATGGC;
– пара 2: 1-GCCATTTGTTCAGTGGTTCG,
– 2-TGGGCGTTCACGGTGGT;
– пара 3: 1-ACCACCGTGAACGCCCA,
– 2-TCTTGTTCCCAAGAATATGGTGA.

Длина первого ПЦР-продукта составила 1103 п.н., второго – 946 и третьего – 1226 п.н. После амплификации выполняли агарозный гель-электрофорез полученных ПЦР-продуктов. В полученных ампликонах измеряли концентрацию ДНК с помощью флуориметра Qubit 2.0 (Invitrogen, США). Далее все 3 продукта амплификации смешивали эквимолярно в одном образце с последующим определением содержания нуклеиновой кислоты в суммированных амплифицированных образцах также при помощи флуориметра Qubit 2. Концентрация ДНК в образцах нормировалась до 15 нг/мкл. Для приготовления индексированных библиотек в реакцию брали по 100 нг каждого образца; библиотеки были приготовлены в соответствии со стандартным протоколом производителя.

Секвенирование NGS проводили на платформе Ion PMG (Life Technologies, США) с использованием чипов типа 316 по стандартному протоколу. Каждый чип вмещал 16 подготовленных индексированных геномных библиотек при теоретической расчётной ёмкости от 300 М до 1 G, т.е. от 300 млн до 1 млрд нуклеотидов. За расчётную величину брали практическую ёмкость в 500 M исходя из длины генома ВГВ, равной ~3200 п.н. Расчётная глубина секвенирования при одновременном исследовании 16 индексированных геномных библиотек составляла ~9700 прочтений на образец. Результаты секвенирования показали, что средняя глубина прочтения разных образцов составила ~1000–10 000.

Выравнивание нуклеотидных последовательностей S-гена и сравнительный анализ первичной нуклеотидной последовательности выполняли при помощи программы Vector NTI 9.0 (ThermoFisher Scientific Inc. (Invitrogen), США). В качестве референсных данных использовали последовательности геномов ВГВ (генотипы А–Н), полученные из базы GenBank. Определение генотипов, субтипов и мутаций ВГВ проводили с учётом данных опубликованных ранее работ [11][25][26]. Для выравнивания последовательностей применяли также следующие референсы из GenBank: JX096956 (Latvia, субгенотип D2) и X98077, субтип adw [27]. В данной статье приведён анализ относительно части гена S, соответствующей S-HBsAg ВГВ.

Оценка escape-мутантов HBsAg с помощью адаптированной методики серологического портретирования с ИФА набором «Гепастрип-мутант-3К». Методика, реализованная в виде иммуноферментного набора «Гепастрип-мутант-3К», основана на данных работы А.И. Баженова и соавт. [20]. Это «сэндвич»-вариант ИФА, разработанный для поиска мутантов НВsAg в позитивных по данному маркёру образцах, отобранных при скрининговом исследовании человеческих сывороток посредством любой универсальной тест-системы. В ходе анализа поликлональные анти-HBs АТ, сорбированные на поверхности лунок планшетов, связывают HBsAg в сыворотке или плазме крови человека, а образовавшийся комплекс антиген–антитело обнаруживается с помощью пероксидазных конъюгатов мышиных моноклональных АТ по цветной реакции с хромогеном. При этом используются 3 конъюгата, обладающих различной специфичностью в отношении к HBsAg дикого и мутантного типов. Конъюгат 11F3 практически не выявляет варианты HBsAg, несущие мутации S143L и G145R, в то время как конъюгат Н2 выявляет как HBsAg дикого типа, так и названные варианты. Третий конъюгат (NF5) реагирует с мутантом в области 143 (но не 145) а.о.

Для каждой исследуемой HBsAg-содержащей сыворотки готовили серию 10-кратных разведений (от 1/10 до 1/1 000 000) в буфере, включающем 125 мМ HEPES ((4-(2-гидроксиэтил)-1-пиперазинэтансульфоновую кислоту)), 438 мМ сахарозу, 192 мМ хлорид натрия, 1,25% (v/v) казеин, 3,3 мM р-гидроксифенил-уксусную кислоту, 5% (w/v) BSA (bovine serum albumin; бычий сывороточный альбумин, БСА), 1% (w/v) человеческий γ-глобулин, 12,2 мкM метиловый оранжевый, 1,95 мкM бромфеноловый красный, 0,1% (v/v) ProClin-300, 10% (w/v) мертиолят, 21,6 мкM амфотерицин В, 0,01% (v/v) гентамицин и 1% (v/v) Твин-20. Каждое разведение сыворотки тестировали с конъюгатами в 4 дублях. Способность конъюгатов выявлять HBsAg в образцах сывороток оценивали относительно HBsAg дикого типа («ИмБио»; АО «НПО «Микроген», Россия), взятого в концентрации 2 мкг/мл.

Рабочие растворы конъюгатов 11F3 (0,8–1,0 мкг/мл), H2 (2 мкг /мл) и NF5 (2 мкг/мл) готовили в буфере, содержащем 0,01 М ЭДТА (этилендиаминтетраацетат), 0,5% (w/o) сухое молоко, 12,5% (v/v) FBS (fetal bovine serum, фетальная бычья сыворотка) (инактивированную 30 мин при 56 °С), 12,5% (v/v) нормальную кроличью сыворотку (инактивированную аналогичным образом), 0,05% (w/o) сапонин, 0,0125% (v/v) Triton Х-405, 0,00625% (v/v) Твин-80, 15 мM калий йодид, 0,1% (v/v) n-пропил-галлат, 0,15 M хлорид натрия, 0,5 M мочевину, 0,005% (w/o) бромкрезоловый пурпурный, 0,35% (w/o) тиоцианат калия, 0,1% (w/v) Цвиттергент, 10 % (w/v) мертиолят (орто-этилртутьтиосалицилат натрия), 21,6 мкM амфотерицин В, 0,01% (v/v) гентамицин в растворе Версена.

Для постановки реакции в лунки планшета из тест-системы «Гепастрип В» с иммобилизованными козьими поликлональными АТ анти-HBs вносили по 50 мкл рабочего раствора конъюгата 11F3, H2 или NF5. Каждый из них тестировали по отдельности со всеми разведениями сыворотки (либо с контрольным антигеном дикого типа). После этого в контрольные лунки планшета добавляли по 100 мкл HBsAg дикого типа или буфер, использующийся для разведения сывороток (отрицательный контроль), а в оставшиеся лунки вносили разведения тестируемых сывороток. Планшет инкубировали во влажной камере при температуре +37 °С на протяжении 2 ч, после чего отмывали 8 раз раствором PBST (Phosphate Buffered Saline Tween 20) (0,15 M хлорид натрия, 2,67 мM натрия гидрофосфат дигидрат, 0,01% азид натрия, 0,1% (v/v) Твин-20; pH 7,2–7,5). Затем во все лунки вносили 100 мкл свежеприготовленного по стандартной методике раствора 3,3’,5,5’-тетраметилбензидина гидрохлорида (ТМБ) в субстратном буфере, содержащем пероксид водорода, и выдерживали 30 мин при +37ºС. Реакцию останавливали добавлением в каждую лунку 50 мкл 2 М серной кислоты, после чего сразу производили учёт результатов на спектрофотометре Sunrise (Tecan, Швейцария) при 450 нм против референсной длины волны 620 нм.

Оценку сравнительной активности конъюгатов проводили для разведений HBsAg-содержащей сыворотки со значениями оптической плотности, позволяющими сравнивать активность 2 конъюгатов, т.е. ≤3,0 (плато).

Сыворотки, имеющие в одинаковых разведениях сходные значения оптической плотности с конъюгатами Н2 и 11F3, относятся к дикому типу. Образцы же, дающие с конъюгатом Н2 значения оптической плотности, превышающие таковые для 11F3 в >10 раз, могут содержать мутацию в положениях 143 или 145 а.о. и требуют дальнейшего исследования. Для этого используется третий конъюгат – NF5, который реагирует с мутантом в области 143 а.о. (но не 145 а.о.). Если реактивность образца сыворотки с конъюгатом Н2 не превышает таковую с NF5 в >10 раз, это означает, что в данной пробе присутствует HBsAg с мутацией в положении 143 а.о. Если же реактивность сыворотки с конъюгатом Н2 превышает таковую в >10 раз как с 11F3, так и с NF5, можно заключить, что имеющийся HBsAg несёт мутацию в позиции 145 а.о.

Исследование проводилось при информированном согласии пациентов. Протокол исследования одобрен Локальным этическим комитетом при ФГБУ «НМИЦ гематологии» Минздрава России (Протокол № 104 от 28.01.2015 г.).

Результаты и обсуждение

По результатам NGS только 5 (8,93%) среди 56 образцов имели мутацию в 143 а.о., причём 4 из них принадлежали группе лиц с онкогематологической патологией. Таким образом, распространённость мутации в позиции 143 а.о. составила 10,81% (4 из 37) (см. табл. 1). При этом 3 из 5 образцов содержали гомогенную мутацию S143T, а 2 оставшихся – мутацию S143L. Все образцы с вариантом S143T, относившиеся к субтипу adw1 генотипов A и D, определены иммуноферментной тест-системой «Гепастрип-мутант-3К» как содержащие дикий тип, несмотря на достаточно высокий уровень вирусной ДНК (105-108 копий/мл). Низкотитражная сыворотка с гетерогенной мутацией S143L, относительное содержание которой составило 31%, также идентифицирована как имеющая дикий тип вируса. Лишь 1 из 5 сывороток с ВГВ, мутантным по 143 а.о. S-HBsAg, правильно определена ИФА тест-системой. Это была высокотитражная сыворотка из группы «Доноры», содержащая ВГВ генотипа D субтипа ayw3 (см. табл. 1).

По сравнению с заменами в 143 а.о. мутация в 145 а.о. S-HBsAg встречалась реже и аналогичным образом доминировала в образцах из группы «Онкогематология», однако лучше детектировалась с помощью ИФА (см. табл. 2). Все 4 обнаруженные замены в 145 а.о. представляли собой мутацию G145R. Таким образом, частота встречаемости этой мутации у онкогематологических больных составила 8,11% (3 из 37), а в целом среди всех исследованных образцов – 7,14% (4 из 56). В 2 случаях мутация оказалась гомогенной, а в 2 других – представленной в виде минорных популяций (22–25%). Оба образца со 100% мутацией G145R правильно идентифицированы иммуноферментной тест-системой. Тем не менее, чувствительность последней оказалась недостаточной для детекции минорных популяций G145R: в одном случае проба определена как дикий тип, а во втором – как замена в 143 а.о. В последнем случае образец ВГВ (№ 66) имел генотип, который можно отнести к рекомбинантной форме D/E. При этом он нёс в S-HBsAg минорную мутацию L216Opal (содержание 21%) наряду с относящимися к мутациям диагностического ускользания заменами V118A и V128A, что, вероятно, могло повлиять на выявление мутации G145R.

Среди оставшихся 47 образцов 8 представляли собой сыворотки со слабовыраженными дефектами по моноклональным конъюгатам (≤10 раз) (табл. 3). Объединяющих их мутаций, позволяющих отчётливо идентифицировать характерный серологический портрет, не обнаружено (табл. 3 и 4). Интересным представляется факт, что escape-мутация D144E, встречавшаяся в гомогенном виде в образцах №№ 65 и 10, показала серологическую реакцию, отличающуюся от картины мутационных изменений в позициях 143 и 145 а.о., несмотря близкую к ним расположенность. В частности, оба образца с заменой D144E имели слабый дефект по конъюгату NF5. Эта же мутация обнаружена ещё в одном образце группы «Онкогематология», однако её содержание не превышало 72%; вероятно, по этой причине в тест-системе «Гепастрип-мутант-3К» не зарегистрирован даже слабый дефект распознавания. Серологический портрет остальных 38 образцов также ничем не отличался от портрета дикого типа вируса.

HBsAg является основным серологическим маркёром для выявления острой и мониторинга хронической ВГВ-инфекции. Уровень ДНК возбудителя у вирусоносителей, которые проходят лечение аналогами нуклеозидов/нуклеотидов, может опускаться ниже предела обнаружения. Поэтому для мониторинга течения хронической ВГВ-инфекции используется количественное определение HBsAg, в т.ч. в фазах иммунотолерантности, иммунного клиренса и иммунного контроля (неактивной фазы), а также при реактивации HBeAg-негативной формы заболевания [12]. Однако при использовании даже самых чувствительных методов определения HBsAg могут иметь место диагностические ошибки. Такая возможность появляется в том случае, если в образце присутствуют escape-мутанты, особенно при их множественном возникновении у одного и того же пациента. Это способствует увеличению эпидемиологической опасности, особенно учитывая накопление мутационных изменений в группах риска [7].

Полученные нами результаты показывают, что рутинный поиск escape-мутантов оправдан именно в таких субпопуляциях, одной из которых являются страдающие онкогематологическими заболеваниями лица. Escape-мутации S143L/T, D144E и G145R выявлены преимущественно у этой категории больных с частотой 10,81, 5,41 и 8,11% соответственно. Чувствительность иммуноферментного выявления этих мутаций оказалась невелика. Наиболее отчётливый результат достигнут при 100% гомогенности мутации и высокой концентрации ДНК ВГВ. Несмотря на это, обнаружена специфичность иммуноферментного выявления замены S143L в отличие от S143T. Кроме того, надёжность выявления мутаций S143L и G145R напрямую связана с глубиной выявляемых серологических дефектов. В случае мутации S143L снижение глубины дефекта распознавания мутантного HBsAg моноклональным конъюгатом 11F3 до величины ≤10 раз приводила к погрешности определения, выявляя в качестве сомнительных образцы с ВГВ, не содержащих такой замены. Это обосновывает необходимость проведения дальнейших экспериментов по уточнению количественных критериев используемой тест-системы.

Другим важным аспектом подхода, описанного в данной работе, может являться применение его в целях разработки и контроля качества вакцин, направленных против escape-мутантов. В такой ситуации рекомбинантный HBsAg с мутацией может рассматриваться как гомогенный белковый препарат, и тест-система «Гепастрип-мутант-3К» позволит отчётливо выявлять правильный фолдинг этого мутантного белка в количественном отношении.

Заключение

Иммуноферментный вариант детекции escapeмутаций S143L, D144E и G145R может быть использован в рутинной лабораторной диагностике, особенно в группах риска. Тем не менее, возможно уточнение параметров диагностической чувствительности и специфичности тест-системы, а также критериев оценки наличия мутационных изменений при дополнительных исследованиях на увеличенной выборке образцов, охарактеризованных молекулярно-биологическими методами. Кроме того, данная тест-система и методика в целом применимы для разработки и контроля качества вакцин против escape-мутантов.

Об авторах

М. В. Коноплeва

ФГБУ «Национальный исследовательский центр эпидемиологии и микробиологии имени почётного академика
Н.Ф. Гамалеи» Минздрава России

Автор, ответственный за переписку.
Email: maria-konopleva@rambler.ru
ORCID iD: 0000-0002-9724-695X

Коноплева Мария Вениаминовна, канд. биол. наук, старший научный сотрудник лаборатории медиаторов и эффекторов иммунитета отдела иммунологии

123098, Москва

Россия

А. А. Фельдшерова

ФГБУ «Национальный исследовательский центр эпидемиологии и микробиологии имени почётного академика
Н.Ф. Гамалеи» Минздрава России

Email: fake@neicon.ru
ORCID iD: 0000-0001-7216-4301

123098, Москва

Россия

Д. А. Эльгорт

ФГБУ «Национальный исследовательский центр эпидемиологии и микробиологии имени почётного академика
Н.Ф. Гамалеи» Минздрава России

Email: fake@neicon.ru
ORCID iD: 0000-0002-2197-4184

123098, Москва

Россия

Т. А. Туполева

ФГБУ «Национальный медицинский исследовательский центр гематологии» Минздрава России

Email: fake@neicon.ru
ORCID iD: 0000-0003-4668-9379

125167, Москва

Россия

Н. А. Кохановская

ФГБУ «Национальный исследовательский центр эпидемиологии и микробиологии имени почётного академика
Н.Ф. Гамалеи» Минздрава России

Email: fake@neicon.ru
ORCID iD: 0000-0001-5142-846X

123098, Москва

Россия

В. Н. Панкратова

ФГБУ «Национальный исследовательский центр эпидемиологии и микробиологии имени почётного академика
Н.Ф. Гамалеи» Минздрава России

Email: fake@neicon.ru
ORCID iD: 0000-0003-4427-1809

123098, Москва

Россия

Т. А. Семененко

ФГБУ «Национальный исследовательский центр эпидемиологии и микробиологии имени почётного академика
Н.Ф. Гамалеи» Минздрава России

Email: fake@neicon.ru
ORCID iD: 0000-0002-6686-9011

123098, Москва

Россия

А. П. Суслов

ФГБУ «Национальный исследовательский центр эпидемиологии и микробиологии имени почётного академика
Н.Ф. Гамалеи» Минздрава России

Email: fake@neicon.ru
ORCID iD: 0000-0001-5731-3284

123098, Москва

Россия

Список литературы

Дополнительные файлы