Геномные изменения вируса африканской чумы свиней (Asfarviridae: Asfivirus: African swine fever virus), связанные с адаптацией к размножению в перевиваемой культуре клеток

Полный текст

Введение

Возбудителем африканской чумы свиней (Suidae) (АЧС) является крупный (175–215 нм) содержащий двухцепочечную ДНК вирус, относящийся к семейству Asfarviridae. Вызываемая им инфекция представляет собой высококонтагиозное заболевание с выраженным геморрагическим синдромом и высоким уровнем смертности у домашних свиней (Sus scrofa domesticus) и диких кабанов (Sus scrofa).

Для изучения основ патогенности и иммуногенности вируса АЧС необходимо проведение сравнительного анализа биологических свойств возбудителя и структуры его генов. Патоген обладает способностью к размножению в первичных культурах клеток (КК) свиней: лейкоцитов, альвеолярных макрофагов и т.д. Однако эти культуры трудно стандартизировать, поскольку их характеристики варьируют в зависимости от особенностей используемого животного. Это значительно затрудняет получение генетически однородного образца вируса, пригодного для анализа. Для решения этой проблемы различные изоляты вируса АЧС были адаптированы к росту в перевиваемой КК, в частности Georgia 2007/1 и BA71 – в культуре Vero. В результате такого адаптационного процесса получены штаммы ASFV-G/V и BA71V [1][2], постепенно утратившие вирулентные свойства. Необходимо отметить, что полногеномное секвенирование было проведено только для вируса BA71V [2].

Поскольку в ходе адаптации к росту в перевиваемых КК вирулентность возбудителя снизилась [3], целью данной работы являлся сравнительный анализ полногеномного сиквенса 2 штаммов вируса АЧС, полученных на уровне 30 и 50 пассажей в культуре клеток CV-1, с генетическим материалом исходного изолята.

Материал и методы

Первичную и перевиваемую культуры клеток CV-1 выращивали в питательной среде Игла с добавлением 20% бычьей фетальной сыворотки (FBS) в соответствии с методическими рекомендациями [4].

С целью выделения геномной ДНК (гДНК) использовали различные варианты вируса АЧС: исходный изолят Odintsovo 02/14 и 2 штамма адаптированного вируса ASFV/ARRIAH/CV-1/30 и ASFV/ARRIAH/CV-1/50. Генетический материал выделяли фенолхлороформным методом, а осадок гДНК элюировали в воде, не содержащей нуклеаз [5]. Библиотеку последовательностей секвенирования конструировали с использованием набора «Nextera XT DNA library preparation kit» («Illumina»). Секвенирование нового поколения (next-generation sequencing, NGS) проводили с применением набора реагентов «MiSeq reagent kit v2» на настольном секвенаторе MiSeq («Illumina», США). Анализ результатов осуществляли в программном обеспечении CLC Genomics Workbench v9.5.2 («Qiagen», Aarhus, Дания; www.clcbio.com); открытые рамки считывания (ОРС) были предсказаны и вычислены при помощи программы GATU.

Полученные последовательности генома анализировали и сравнивали со структурой гДНК штамма FR682468.1_ASFV/Georgia 2007/1. Полные последовательности были депонированы в GenBank с номерами доступа MW528217 и MW528218.

Для построения выравнивания и обнаружения точечных мутаций в виде однонуклеотидных полиморфизмов (single nucleotide polymorphisms, SNPs) использовали программу CLC Genomics Workbench v9.5.2.

Результаты

В ФГБУ ВНИИЗЖ были детально изучены биологические и генетические характеристики изолята вируса АЧС ASFV Odintsovo 02/14 [6], поэтому данную
его разновидность использовали для адаптации к росту в перевиваемой культуре фибробластоподобных
псевдодиплоидных клеток африканской зелёной мартышки (Cercopithecus aethiops) (CV-1).

В ходе проведённых экспериментов получены штаммы вируса АЧС, которые обладали способностью к репродукции в непермиссивной КК CV-1. Определены биологические свойства и полноразмерная последовательность геномов этих штаммов, полученных на уровне 30 и 50 пассажей и адаптированных к клеточной культуре (ASFV/ARRIAH/CV-1/30 и ASFV/ARRIAH/CV-1/50 соответственно). Исследования выявили существенное снижение вирулентности изолята ASFV/ARRIAH/CV-1/30 (~ <20 %), однако его геном в постадаптационный период не был удовлетворительно охарактеризован [3].

В процессе опытов удалось установить характер влияния адаптации возбудителя АЧС к росту в перевиваемой КК на структуру его генома, а также выявить мутации, возникшие в результате адаптационного процесса. Установлено, что длина ДНК у штаммов ASFV/ARRIAH/CV-1/30 и ASFV/ARRIAH/CV-1/50 составила 186 529 и 186 525 п.н. соответственно. Между исходным и адаптированными вариантами обнаружены различия, проявившиеся в наличии у последних 78 однонуклеотидных полиморфизмов, а также значительной делеции (2947 п.н.) в 3’-концевом вариабельном регионе между 181 980–184 929 п.н. Аналогичная делеция ранее описана в геноме штамма BA71V – другого адаптированного к росту в культуре Vero варианта вируса [2].

Наблюдаемые различия в размере последовательности полных геномов анализируемых штаммов ASFV/ARRIAH/CV-1/30 и ASFV/ARRIAH/CV-1/50, составили лишь 4 п.н., тогда как у Georgia 2007/1 (189 344 п.н.) и Odintsovo 02/14 (189 122 п.н.) они составляли 222 п.н. Разность длины геномов исходного изолята и его адаптированных вариантов превышала 2590 п.н. (2,9 kb), что указывает на наличие крупноразмерной делеции в генетических последовательностях обоих штаммов вируса.

Из 78 SNPs между родительским штаммом Odintsovo 02/14 и двумя адаптированными штаммами 13 располагаются внутри межгенных областей, а 5 удалить также связаны с повторяющимися нуклеотидами гомополимера. Находящиеся внутри ОРС 8 SNP охарактеризованы как синонимичные, а 52 – как несинонимичные. Данные обо всех 60 синонимичных и несинонимичных SNP приведены в табл. 1.

Как видно из таблицы, большинство (n = 36) несинонимичных SNP являются консервативными заменами аминокислотных остатков, тогда как 14 олигонуклеотидных полиморфизмов привели к появлению в определённой последовательности белка незаряженной или иной заряженной аминокислоты.

Из несинонимичных олигонуклеотидных полиморфизмов 2 вызвали образование в гене стоп-кодона, что, в свою очередь, не позволяет осуществить полноценный белковый синтез либо полностью блокирует построение предсказанного белка (табл. 2). Результаты анализа влияния нуклеотидных замен с появлением стоп-кодона или с проявлением неконсервативного замена аминокислот в различных белковых последовательностях вируса АЧС приведены в табл. 2; в ней также указаны белки, отсутствующие из-за делеции 2,9 kb в составе генома.

Представленные результаты наглядно демонстрируют, что большинство замен аминокислотных остатков происходило в геноме адаптированных вариантов ASFV/ARRIAH/CV-1/50 и/или ASFV/ARRIAH/CV-1/30, за исключением мутаций, которые были уникальными для генома изолята Odintsovo 02/14 (в таблице выделены серым цветом).

Обсуждение

При определённых условиях возбудитель АЧС как ДНК-содержащий вирус может не иметь высокой изменчивости генома, однако, поскольку на настоящий момент эффективная вакцинопрофилактика при АЧС не разработана, значительное место в изучении данного вируса занимают исследования основ его патогенности и иммуногенности. При этом основным инструментом служит выявление взаимосвязи проявления тех или иных биологических свойств патогена и особенностей структуры его генома.

Поскольку ранее установлено, что адаптация возбудителя АЧС к росту в перевиваемой культуре клеток приводит к значительным изменениям в генетическом материале и снижению вирулентности [3][7], наиболее информативным подходом в изучении механизмов патогенности вируса АЧС следует признать анализ происходящих при его адаптации изменений в геноме. Указанные предпосылки обусловливают необходимость получения варианта вируса, адаптированного к росту в перевиваемой КК.

В представленной работе наглядно продемонстрировано, что адаптация патогена к росту в перевиваемой культуре CV-1 ведёт к появлению крупноразмерной делеции в 3’-вариабельной области. Сравнительный анализ полногеномных последовательностей исходного штамма и адаптированных вариантов позволил также выявить 78 олигонуклеотидных полиморфизмов, которые влияли на предсказанную аминокислотную последовательность кодируемого белка или не оказывали подобного влияния. Лишь 2 олигонуклеотидные замены (в генах MGF_110_1L и B354L) имели результатом образование стоп-кодонов, что даёт основание исключить возможность полноценного синтеза кодируемых ими белков при инфицировании объектов вирусом штамма ASFV/ARRIAH/CV-1/50.

Заключение

Таким образом, наряду с обнаружением значительного количества SNP у 2 адаптированных вариантов вируса АЧС наиболее значимой модификацией в геномах ASFV/ARRIAH/CV-1/30 и ASFV/ARRIAH/CV-1/50 была крупноразмерная делеция в 2947 п.н. в правой (3’-вариабельной) области обоих штаммов в участке между 181 975–184 920 п.н. Подобная делеция также описана в геноме другого штамма – BA71V, также адаптированного к росту в перевиваемой КК, где были затронуты те же 7 предсказанных белков (см. табл. 2). Однако ввиду недостаточной на сегодняшний день изученности этого вопроса и малого количества публикаций по теме требуются дополнительные исследования для подтверждения характера влияния каждого из описанных изменений на репликацию вируса, его иммуногенность и степень проявления вирулентных свойств.

Об авторах

А. А. Мазлум

ФГБУ «Федеральный центр охраны здоровья животных» (ВНИИЗЖ)

Автор, ответственный за переписку.
Email: ali.mazloum6@gmail.com
ORCID iD: 0000-0002-5982-8393

Мазлум Али, канд. биол. наук, ведущий ветеринар

600901, Владимирская обл., Владимир, мкр. Юрьевец

Россия

А. С. Иголкин

ФГБУ «Федеральный центр охраны здоровья животных» (ВНИИЗЖ)

Email: fake@neicon.ru
ORCID iD: 0000-0002-5438-8026

600901, Владимирская обл., Владимир, мкр. Юрьевец

Россия

Н. Г. Зиняков

ФГБУ «Федеральный центр охраны здоровья животных» (ВНИИЗЖ)

Email: fake@neicon.ru
ORCID iD: 0000-0002-3015-5594

600901, Владимирская обл., Владимир, мкр. Юрьевец

Россия

А. ван Шалквик

Ветеринарный институт Ондерстепорта

Email: fake@neicon.ru
ORCID iD: 0000-0003-4761-8767

100 Олд Саутпен Роад, Ондерстепорт 0110

ЮАР

Н. Н. Власова

ФГБУ «Федеральный центр охраны здоровья животных» (ВНИИЗЖ)

Email: fake@neicon.ru
ORCID iD: 0000-0001-8707-7710

600901, Владимирская обл., Владимир, мкр. Юрьевец

Россия

Список литературы

Дополнительные файлы