Изучение тератогенности вакцинного штамма вируса краснухи «Орлов-В» (Matonaviridae: Rubivirus: Rubella virus) в опыте на обезьянах макак-резус

Полный текст

Введение

В связи со значительной тератогенностью вируса краснухи и содержанием аттенуированного вакцин­ного штамма в составе живой вакцины беременность является противопоказанием для вакцинирования против этого заболевания [1][2]. Имеется ряд публи­каций, свидетельствующих о возможности проник­новения вакцинных штаммов вируса краснухи через плаценту [3][4].

Так, в Великобритании при обследовании 515 жен­щин, по тем или иным причинам привитых против краснухи в период беременности, у рождённых де­тей не было выявлено признаков синдрома врождён­ной краснухи (СВК), хотя в 10,6% случаев опреде­лялось внутриутробное инфицирование плода [5]. В Иране в 2003 г. при обследовании новорождённых, родившихся от вакцинированных во время беремен­ности матерей (при проведении массовой иммуни­зации против кори и краснухи), у 5 детей были об­наружены антитела класса IgM в пуповинной кро­ви, однако ни у одного ребёнка не было выявлено пороков развития, аналогичных наблюдаемым при СВК [6]. По данным Mangtani P., Evans S.J.W. et al. теоретический риск поражения плода при вак­цинации беременных против краснухи составляет от 0 до 0,6%, что значительно ниже, чем риск раз­вития СВК вследствие первичного инфицирования женщины в течение первых 12 недель гестационно- го срока [7]. В связи с этим ряд учёных пришли к за­ключению, что непреднамеренная вакцинация при наличии беременности не является показанием к её прерыванию [1][7][8][9].

Однако штаммы для живой рубеолярной вакцины, предназначенные для парентерального введения лю­дям, должны тщательно изучаться в отношении воз­можного тератогенного действия [10]. Понятно, что изучение тератогенного потенциала вновь разраба­тываемых медицинских иммунобиологических пре­паратов (МИБП) возможно лишь в эксперименте на соответствующей лабораторной модели [11].

Наиболее адекватной моделью для изучения виру­са краснухи являются лабораторные приматы. Этот возбудитель патогенен, в частности, для обезьян макак-резус (Macaca mulatta; Macaca rhesus), чув­ствительных к интраназальному, внутримышечному и внутривенному заражению. Патогенез вызываемого им заболевания сходен с таковым у человека по таким параметрам, как продолжительность инкубационного периода и вирусовыделения, наличие вирусемии, ди­намика формирования вирусспецифических антител [12]. Экспериментально доказанное развитие виру­семии при заражении макак-резус патогенным штам­мом вируса краснухи [13] свидетельствует о возмож­ности проникновения возбудителя через плаценту, что, в свою очередь, позволяет использовать эту мо­дель для контроля возможного тератогенного дей­ствия вакцинных штаммов.

Вакцинный штамм «Орлов-В» [14] был восстанов­лен в ФБУН «Санкт-Петербургский научно-исследо­вательский институт эпидемиологии и микробиоло­гии им. Пастера» («Санкт-Петербургский НИИЭМ им. Пастера») после многолетнего хранения исход­ного штамма «Орлов» при температуре -20 ^оС про­ведением дополнительных пассажей в тканевом суб­страте, использовавшемся для аттенуации исходного вируса, - первичной культуре клеток почки кролика (ППК). В таких условиях возможны различия со­хранности основных биологических характеристик вирусных частиц, составляющих гетерогенную по­пуляцию исходного пула культуральной вируссодер­жащей жидкости (ВСЖ). В связи с этим тщательный контроль безопасности применения, в том числе кон­троль утраты тератогенных свойств, присущих диким штаммам, рассматривается как необходимый этап доклинического изучения вакцинного штамма для живой аттенуированной вакцины против краснухи. В экспериментах подобного рода необходимым явля­ется использование препарата сравнения - вакцины однонаправленного действия, желательно коммерче­ского производства [10].

Целью исследования являлось комплексное изучение тератогенных свойств вакцинного штамма вируса крас­нухи «Орлов-В» в опыте на обезьянах макак-резус.

Материал и методы

В работе использованы вакцинные штаммы вируса краснухи «Орлов-В» (39 пассажей в культуре клеток ППК) и Wistar RA27/3 (в составе живой аттенуиро­ванной вакцины производства ФГУП «НПО «Ми­кроген», Москва, Россия). Лабораторные животные - самки макак-резус в возрасте 4-7 лет на ранних сроках (первая треть - первая половина) гестации в количестве 13 особей. Сформированы 3 груп­пы: 9 самок иммунизировали препаратом из штамма «Орлов-В», 3 самок - препаратом сравнения (вакцин­ный штамм Wistar RA27/3) и 1 особи вводили плаце­бо (растворитель вакцины против краснухи).

Обращение с животными проводилось в строгом соответствии с Правилами содержания и ухода за не­человекообразными приматами (ГОСТ 33216-2014).

Иммунизацию животных осуществляли однократ­ным внутримышечным введением серонегативным к краснухе самкам 0,5 мл препаратов из исследуемых штаммов. Прививочная доза соответствовала 1 при­вивочной дозе для человека (не менее 1000 ТЦД₅₀).

Изучение потенциальных тератогенных свойств вак­цинных штаммов вируса краснухи проводили с исполь­зованием комплекса клинических, иммунологических, патоморфологических и вирусологических методов.

Клиническое наблюдение за новорождёнными про­водили ежедневно. Результаты его регистрировали дважды: сразу после рождения и через 90 суток на­блюдения. У новорождённых особей изучали дви­гательную активность (объём и силу движений в ко­нечностях, способность сопротивляться извлечению из клетки и насильственному разгибанию и сгибанию конечностей); мышечную активность (самостоятель­ное удерживание на матери); сосательный рефлекс. Степень формирования скелета регистрировали од­нократно рентгенологически. На протяжении периода наблюдения проводили периодическое взвешивание детёнышей. Через 90 суток наблюдения оценивали двигательные функции, координацию движений (по способности животных совершать координированные движения конечностями при захватывании предме­тов). Мышечный тонус определяли при пальпирова­нии мышц конечностей в спокойном состоянии и при сгибании-разгибании. Фиксировали также наличие тремора, гиперкинезы; остроту зрения и слуха; аппе­тит, стул, динамику прибавки массы тела.

Определение титров антител в сыворотке крови иммунизированных беременных обезьян проводили в РТГА через 28-30 суток после иммунизации, ис­пользуя «Диагностикум краснушный антигенный су­хой для РТГА» производства ОНТ ФБУН «Санкт-Пе­тербургский НИИЭМ им. Пастера» (Санкт-Петербург, Россия) в соответствии с инструкцией по примене­нию препарата.

Иммуноглобулины класса IgM определяли в сыво­ротке крови детёнышей первого месяца жизни, ро­дившихся от иммунизированных во время беремен­ности самок. Для определения IgM-антител применя­ли ИФА-тест-систему «Вектор-Рубелла-IgM-стрип» (Новосибирск, Россия) в соответствии с инструкцией по применению. Все образцы сыворотки были за­шифрованы и исследовались одновременно.

У 2 новорождённых, погибших в родах, произво­дили аутопсию, патоморфологическое изучение вну­тренних органов. Исследование тканей и органов обезьян проведено в лаборатории патоморфологии ФГБНУ «НИИ медицинской приматологии». Гисто­логическому исследованию (с окраской гематоксили­ном и эозином и по методу Ниссля) были подвергнуты головной мозг, лёгкое, печень, почка, поджелудочная железа, селезёнка новорождённых, а также плацента самок.

Для установления возможного наличия РНК вируса краснухи в образцах тканей погибших в родах осо­бей, плаценте и пуповинной крови использовали ме­тод ПЦР с электрофоретической детекцией продуктов амплификации. Экстракцию РНК из исследуемого материала производили при помощи набора реаген­тов «РИБО-сорб» (ООО «ИнтерЛабСервис», Москва, Россия), для проведения реакции обратной транс­крипции - «РЕВЕРТА-L» (ООО «ИнтерЛабСервис», Москва, Россия); амплификацию комплементарной ДНК (кДНК) выполняли с использованием набора реагентов «АмплиСенс Rubella virus-EРh» (ФГУН «Центральный НИИ эпидемиологии» Роспотребнад­зора, Москва, Россия). Все этапы реакции проводили по стандартной схеме в соответствии с инструкцией по применению. Процедуру амплификации осущест­вляли на программируемом термостате ТП4-ПЦР-01- «Терцик» (ООО «НПО ДНК-Технология», Протвино, Россия).

Результаты

Беременность 11 из 13 самок разрешилась нормаль­ными срочными родами; в 2 случаях (1 - самка, имму­низированная препаратом из штамма «Орлов-В», 1 - препаратом из штамма Wistar RA27/3) беременность завершилась мертворождением вследствие родовой травмы.

На протяжении 90 суток после рождения детё­ныши ежедневно осматривались врачом-ветерина- ром для оценки наличия или отсутствия отставания в развитии, клинических симптомов поражения центральной нервной системы, дыхательной систе­мы, органов слуха и зрения. Ни у одной из особей, родившихся живыми и получавших грудное вскарм­ливание, внешних пороков и аномалий развития выявлено не было. Детёныши развивались активно; их поведение, масса тела, слух, зрение и структу­ра костного аппарата соответствовали возрастной норме. При рентгенологическом исследовании ске­лета у 2 из них (по 1 из групп «Орлов-В», инвен­тарный №40066, и плацебо, инвентарный №39978) были выявлены рахитоподобные изменения, однако они не являлись вирусспецифическими и связаны с особенностями питания животных.

Для определения возможной связи смерти 2 детё­нышей с вакцинацией их матерей во время беремен­ности было проведено патоморфологическое и ви­русологическое исследование их органов и тканей, а также плаценты самок. Ни в одном случае вирус- специфических поражений у погибших новорождён­ных выявлено не было. Гистологическая картина головного мозга и периферических органов соот­ветствовала норме. Таким образом, в обоих случаях смерть наступила по причинам, не связанным с ма­теринской иммунизацией против краснухи во время беременности.

При проведении вирусологического исследования с целью сравнения использовали аутопсийный ма­териал детёныша, не включённого в настоящий экс­перимент и погибшего от алиментарной дистрофии из-за отсутствия грудного вскармливания (агалактия у матери) (инвентарный №32771).

Ни в одном из исследованных образцов РНК вируса краснухи обнаружена не была (рисунок), что свиде­тельствует об отсутствии проникновения вакцинных штаммов вируса через плаценту и, соответственно, отсутствии внутриутробного инфицирования плода в каждом из исследованных случаев гибели новорож­дённого.

Изучение сывороток крови самок, однократно им­мунизированных против краснухи во время беремен­ности, показало 100%-ную сероконверсию, т.е. все подопытные животные ответили на введение вакцин­ных препаратов образованием специфических анти­тел в высоких титрах. В то же время по окончании периода наблюдения в сыворотке обезьяны группы плацебо специфические антитела не определялись (таблица).

E. Miller и соавт. показали, что частота выявления антител класса IgM в сыворотках крови детей с вну­триутробной инфекцией рубеолярной этиологии мак­симальна в первый месяц жизни, когда она составля­ет 100% [15]. На основании этих данных исследова­ние сывороток детёнышей на наличие IgM-фракции противокраснушных антител проводили, собирая об­разцы крови в течение первых 30 суток после рожде­ния. В качестве положительного и отрицательного контроля (помимо контролей, заложенных в тест-си­стеме) были исследованы сыворотки крови 2 людей: одна, полученная от больного с лабораторно под­тверждённой краснухой, другая - от больного с от­рицательным результатом на IgM-антитела к вирусу краснухи. Ни в одном случае в сыворотке крови детё­нышей, родившихся от иммунизированных во время беременности матерей, не было выявлено противо- краснушных IgM.

 

 

Обсуждение

Учитывая способность вируса краснухи проникать через плаценту и вызывать множественные систем­ные поражения плода, контроль утраты тератогенных свойств у вакцинных штаммов для живой краснушной вакцины представляется необходимым и важным эта­пом доклинического изучения таких препаратов. Мо­делью для проведения настоящего исследования стал вакцинный штамм вируса краснухи «Орлов-В», полу­ченный путём аттенуации дикого вируса серийными пассажами в культуре клеток почки кролика. В каче­стве препарата сравнения использован штамм Wistar RA27/3, входящий в состав всех используемых в на­стоящее время коммерческих вакцин против краснухи.

В ходе эксперимента получены данные по клини­ческому наблюдению за детёнышами, родившими­ся от вакцинированных во время беременности ма­как-резусов. Все 11 особей были оценены врачом-ве- теринаром как клинически здоровые; первый месяц ежедневного клинического наблюдения не выявил ни в одном случае задержки в развитии условных рефлексов. Периодическое взвешивание не обнару­жило отставания в физическом развитии. В дальней­шем в течение 3 месяцев наблюдения каких-либо па­тологических состояний ни у одного из подопытных животных выявлено не было.

Учитывая, что одним из частых проявлений СВК является повышенная проницаемость тканей костно­го аппарата [16], было проведено рентгенологическое обследование новорождённых для установления воз­можных несоответствий развития скелета физиологи­ческой возрастной норме. Ни в одном случае не было выявлено характерных для СВК костных поражений. Обнаруженные у 2 особей (1 иммунизированнной штаммом «Орлов-В» и 1 - растворителем вакцины против краснухи) рахитоподобные изменения в росто­вых зонах наиболее быстро растущих костей оценены врачом-рентгенологом как неспецифические.

 

Вирусологическое исследование тканей плаценты (методом ПЦР) для определения возможного наличия РНК вируса краснухи удалось провести в 3 случаях. Ни в одном из исследованных образцов плаценты (2 группы «Орлов-В» и 1 - группы Wistar RA27/3), а также пуповинной крови (1 образец группы «Орлов-В»), не было выявлено вирусной РНК.

Тщательное и всестороннее патоморфологическое исследование тканей и органов детёнышей, погиб­ших во время родов (1 - группа «Орлов-В»; 1 - Wistar RA27/3), также не выявило вирусспецифических по­ражений органов и тканей.

В конечной стадии эксперимента сыворотки крови самок были исследованы в РТГА на наличие противо- краснушных антител; детёнышей - на наличие IgM- фракции антител.

Результаты РТГА свидетельствуют о развитии вы­раженного иммунного ответа на вакцинацию препа­ратами из штаммов «Орлов-В» и Wistar RA27/3 и под­тверждают факт иммунизации животных.

Известно, что в отличие от противовирусных IgG- антител, передающихся от матери к плоду и обеспе­чивающих пассивный противовирусный иммунитет на протяжении первых месяцев жизни, иммуноглобу­лины класса IgM не проходят через плаценту [17]. Их присутствие в крови новорождённых свидетельству­ет о развитии внутриутробной инфекции. Это обстоя­тельство было убедительно доказано E. Miller и соавт. в когортных исследованиях детей, рождённых с вну­триутробными инфекциями (ВУИ) рубеолярной этио­логии [15]. В связи с этим согласно классификации ВОЗ диагноз «врождённая краснуха» устанавлива­ется только на основании обнаружения в крови мла­денца IgM-антител к вирусу краснухи даже без на­личия клинической симптоматики заболевания [18]. Следовательно, обнаружение иммуноглобулинов этого класса в крови особей, родившихся от иммуни­зированных против краснухи матерей, было бы без­условным свидетельством сохранения тератогенных свойств вакцинного вируса. И напротив, отсутствие таковых - убедительное доказательство того, что штаммы, использованные в настоящем исследова­нии, не вызывают внутриутробного инфицирования плода. Важно, что такие результаты получены без умерщвления детёнышей, что полностью отвечает принципам гуманного обращения с лабораторными животными.

Следует особо отметить, что использование ПЦР для детекции РНК вируса краснухи в аутопсийном материале, плаценте и пуповинной крови может слу­жить объективным маркёром для оценки потенциаль­ного тератогенного действия [19] испытываемых пре­паратов на этапе их доклинического изучения.

Заключение

В ходе изучения возможного тератогенного действия вакцинных штаммов вируса краснухи в опыте на обезьянах макак-резус ни в одном слу­чае не было получено каких-либо данных, свиде­тельствующих о внутриутробном инфицировании плода иммунизированных во время беременности самок. Таким образом, результаты проведённо­го исследования показали отсутствие тератоген­ных свойств в условиях данного эксперимента как у вакцинного штамма вируса краснухи «Орлов-В», так и у штамма Wistar RA27/3, использованного в качестве препарата сравнения и входящего в со­став коммерческих вакцин против краснухи. Пока­зана информативность ПЦР как теста, подтвержда­ющего специфическую безопасность вакцинных штаммов для живых вирусных вакцин на этапе их доклинического изучения.

Об авторах

И. Н. Лаврентьева

ФБУН «СанктПетербургский научно-исследовательский институт эпидемиологии и микробиологии им. Пастера» Роспотребнадзора

Email: pasteur.lawr@mail.ru
ORCID iD: 0000-0002-2188-6547

д.м.н., зав. лаборатории экспериментальной вирусологии 

197101, Санкт-Петербург

Россия

О. А. Шамсутдинова

ФГБНУ «Научно-исследовательский институт медицинской приматологии» Минобрнауки

Автор, ответственный за переписку.
Email: shamsutdinova-o-a@yandex.ru
ORCID iD: 0000-0002-2742-3965

научный сотрудник лаборатории иммунологии и биологии клетки

354376, Сочи

Россия

И. И. Чугуева

ФГБНУ «Научно-исследовательский институт медицинской приматологии» Минобрнауки

Email: Chuguevairina@mail.ru
ORCID iD: 0000-0002-1567-1929

ветеринарный врач

354376, Сочи

Россия

Д. Д. Карал-оглы

ФГБНУ «Научно-исследовательский институт медицинской приматологии» Минобрнауки

Email: karal_5@mail.ru
ORCID iD: 0000-0003-3606-1668

к.б.н., ведущий научный сотрудник лаб. иммунологии и биологии клетки

354376, Сочи

Россия

О. И. Вышемирский

ФГБНУ «Научно-исследовательский институт медицинской приматологии» Минобрнауки

Email: olegvyshem@mail.ru
ORCID iD: 0000-0002-5345-8926

к.м.н., ведущий научный сотрудник лаборатории инфекционной вирусологии

354376, Сочи

Россия

Список литературы

Дополнительные файлы