Разработка инактивированной культуральной вакцины против жёлтой лихорадки

Полный текст

Введение

Жёлтая лихорадка (ЖЛ) – острое геморрагическое трансмиссивное заболевание вирусной этиологии (возбудитель – флавивирус; род Flavivirus, семейство Flaviviridae). ЖЛ является тропическим зооантропонозом Африки и Южной Америки. Вирус передаётся человеку через укус комаров определённых видов, преимущественно Aedes aegypti, уровень летальности составляет 20–50% и выше. Поскольку большинство случаев ЖЛ остаётся вне регистрации, специалисты Всемирной организации здравоохранения (ВОЗ) определили, что истинный уровень заболеваемости в год может достигать 200 тыс. случаев [1].

Единственная на сегодняшний день доступная живая вакцина против ЖЛ на основе куриных эмбрионов, инфицированных аттенуированным штаммом 17D вируса ЖЛ, была разработана в 1936 г. M. Theiler и H.H. Smith [2]. Это один из наиболее эффективных вакцинных препаратов за всю историю вакцинологии – протективный иммунный ответ наблюдается у 99% вакцинированных [1]. Вакцину выпускают во Франции (Sanofi Pasteur), в Сенегале (Institut Pasteur de Dakar), Бразилии (Bio-Manguinhos) и в Российской Федерации (ФГБНУ «ФНЦИРИП им. М.П. Чумакова РАН»), она пользуется устойчивым спросом в эндемичных по ЖЛ регионах [3].

За почти 80-летнюю историю применения данной вакцины число вакцинированных превысило 550 млн человек [1]. Однако применение живой вакцины ассоциировано с рядом тяжёлых поствакцинальных осложнений – висцеротропным синдромом (примерно 0,4 случая на 100 тыс. вакцинированных), нейротропным синдромом и аллергическими реакциями на яичный белок [4][5]. Учитывая тот факт, что вакцинации подлежат все лица с 9-месячного возраста (в случае эпидемии – с 6-месячного возраста), проживающие в регионах риска [1], а также лица, выезжающие в эти регионы (работа, туризм и т.д.), разработка и внедрение высокоочищенной инактивированной вакцины против ЖЛ призвана обеспечить максимальную безопасность вакцинации против одного из самых распространённых вирусных заболеваний человека. За последние 10 лет исследователями США и Бразилии опубликованы материалы
по разработке принципиальных подходов к созданию инактивированной культуральной вакцины против ЖЛ [1][6], которые наряду с собственными методическими приёмами использовали авторы данной статьи.

Цель исследования – разработка и оценка иммуногенности инактивированной культуральной вакцины против ЖЛ на уровне лабораторной модели.

Материал и методы

Вирус. Использовали штамм 17D вируса ЖЛ – рабочий посевной вирус, полученный из отделения вакцины жёлтой лихорадки ФГБНУ «ФНЦИРИП им. М.П. Чумакова РАН».

Клетки. Клетки Vero культивировали в среде DMEM с 5% эмбриональной сыворотки крупного рогатого скота (Gibco, Великобритания).

Приготовление инактивированной вакцины вируса ЖЛ. Клетки Vero заражали вирусом ЖЛ, штамм 17D(оптимальная множественность заражения – 0,01 БОЕ/кл.). Культивировали в среде Игла МЕМ с L-глутамином, двойным набором аминокислот и витаминов (ФГБНУ «ФНЦИРИП им. М.П. Чумакова РАН») в культуральных флаконах с площадью рабочей поверхности 225 см². Кроме того использовали роллерное культивирование: ёмкость флаконов – 1,7 л, объём среды – 300 мл. Титр вируса по методу бляшек [6] составлял (±) 6,0 lg БОЕ/мл. Вируссодержащую культуральную жидкость в количестве 4,5 л осветляли центрифугированием при 10 000 об/ мин в течение 20 мин при температуре +4 ºС, затем с помощью фильтра Sartobran^® 300, 0,45 + 0,2 мкм (Sartorius, Германия). Для удаления клеточной ДНК обрабатывали нуклеазой Benzonase^® (Novagen^®, Дания): 50 ЕД/мл + 2 мМ MgCl2 в течение 24 ч при температуре 37 ºС, перемешивая. Затем инактивировали 0,1% β-пропиолактоном (Serva, Германия) в течение 16 ч при комнатной температуре с периодическим перемешиванием и контролем pH, не допуская закисления в результате образования кислых продуктов гидролиза β-пропиолактона [1]. Остаточную инфекционность контролировали в соответствии с [6].

Инактивированную культуральную жидкость концентрировали в 200 раз методом ультрафильтрации в тангенциальном потоке с использованием установки Vivaflow 200 (Sartorius, Германия). В полученном концентрате определяли титр антигена вируса ЖЛ с помощью собственной системы иммуноферментного анализа (ИФА) по ранее опубликованной методике [7].

Для очистки инактивированного вируса ЖЛ использовали гель CaptoTM Core 700 (GE Healthcare, Швеция), позволяющий проводить гель-фильтрацию с более высоким уровнем разделения за счёт связывания низкомолекулярных соединений с «ядром» геля. На колонку с гелем CaptoTM Core 700 (30×1,5 см), уравновешенную 0,01 М фосфатно-солевым буфером (ФСБ), pH 7,2, наносили 5 мл концентрата инактивированного вируса ЖЛ, элюировали тем же буфером со скоростью 5–7 мл/мин, собирая фракции объёмом 5 мл. Измеряли оптическую плотность (ОП) фракций при 280 и 260 нм, а также определяли наличие антигена вируса ЖЛ с помощью ИФА, как указано выше [7]. Фракции с максимальным содержанием антигена вируса ЖЛ по данным ИФА представляли собой лабораторный вариант инактивированной вакцины против ЖЛ. Их стерилизовали фильтрацией (фильтры диаметром 0,45 мкм), определяли концентрацию белка по методу Бредфорда [8], хранили при +4 ºС.

Оценка иммуногенности лабораторных серий инактивированной вакцины против вируса ЖЛ. Иммуногенность оценивали на модели мышей BALB/c (самки 4–6-недельного возраста) согласно T. Monath и соавт. [1]. Мышей (7 животных в группе) иммунизировали различными дозами вакцины (по концентрации общего белка – 12,5, 25 и 50 мкг/мл) без адъюванта внутримышечно (бедренные мышцы, по 0,05 мл в каждую конечность, всего 0,1 мл на иммунизацию) 3 раза с интервалом 2 нед. Через 2 нед после 3-й иммунизации брали кровь из ярёмной вены. В качестве положительного контроля использовали коммерческую живую вакцину против ЖЛ производства ФГБНУ «ФНЦИРИП им. М.П. Чумакова РАН» в дозе, предписанной для вакцинации людей (3,2 lg БОЕ / 0,5 мл) по аналогичной схеме (0,1 мл на одну иммунизацию). В качестве негативного контроля животным вводили ФСБ.

Определение специфических антител (против вируса ЖЛ) класса G (IgG) в сыворотках крови иммунизированных мышей. Использовали собственный вариант ИФА: препарат инактивированной вакцины против вируса ЖЛ сорбировали в лунки иммунопанели (Costar, кат. № 9018, США) в концентрации 10 мкг/мл в карбонат-бикарбонатном буфере, рН 9,6 (Sigma, кат. № C3041-100 CAP) по 0,1 мл/лунка, инкубировали 18 ч при +4 ºС. После 3-кратной отмывки 0,05% Tween-20 ФСБ (Т-ФСБ) и блокирования свободных сайтов 1% сывороткой крови телёнка (Gibco, Великобритания) по 0,2 мл/лунка в течение 1 ч при +4 ºС и 3-кратной отмывки вносили (0,1 мл/лунка) разведения анализируемых сывороток мышей, начиная с 1 : 100 в Т-ФСБ.

Положительный контроль: референс-сыворотка крови зелёной мартышки, полученная из ВОЗ (WHO Reference Reagent, The 1^st International Reference Preparation for Anti-Yellow Fever, Serum, Monkey, NIBSC code: YF, Великобритания).

Отрицательный контроль: сыворотки крови невакцинированных мышей линии BALB/c. Инкубировали 1 ч при +37 ºС. После 5-кратной отмывки вносили (0,1 мл/лунка) соответствующий пероксидазный конъюгат – против IgG мыши (Sigma, кат № A4416-1 ml, США) и против IgG обезьяны для референс-сыворотки (Sigma, кат № A2054-1 ml, США) в оптимальном разведении (в Т-ФСБ), подобранном шахматным титрованием. Инкубировали 1 ч при +37 ºС. После 5-кратной отмывки вносили (0,1 мл/лунка) субстрат TMB (Sigma, кат. № T0440-100 ml, США), инкубировали 30 мин в темноте при комнатной температуре. Реакцию останавливали 2М раствором серной кислоты (0,05 мл/лунка). ОП измеряли при 450 нм (Thermo Scientific Multiscan FC ELISA reader, Thermo Labsystems, Финляндия). Результат считали положительным при значении P/N (ОП опыта / ОП контроля в максимальных разведениях сыворотки крови) ≥ 2,1 [9].

Определение специфических вирус-нейтрализующих антител (против вируса ЖЛ) в сыворотках крови иммунизированных мышей проводили методом редукции числа бляшек, согласно S. Mercier-Delarue и соавт. [10]. Разрешающая доза вируса – 100 БОЕ / 0,1 мл. Параллельно тестировали анти-ВЖЛ референс-сыворотку обезьяны и сыворотки крови невакцинированных мышей линии BALB/c.

Статистическую обработку результатов проводили с использованием программного обеспечения Microsoft Excel.

Результаты

Всего изготовлено и охарактеризовано 8 лабораторных серий вакцины. На рисунке представлен результат очистки ЖЛ – типичный профиль элюции инактивированного концентрата вируса ЖЛ на колонке с Capto^TM Core 700. Из данных рисунка следует, что только фракции 3 и 4 первого пика содержат специфический антиген вируса ЖЛ по данным ИФА (450 нм). Фракции второго (7–13) и третьего пика (18) свободны от специфического антигена. Таким образом, объединённые фракции 3 и 4 представляют собой препарат инактивированной вакцины от ЖЛ. Концентрация общего белка в препаратах вакцины от ЖЛ после очистки на колонке с CaptoTM Core 700 составляла в среднем 200 мкг/мл.

В табл. 1 представлены результаты (средние значения) оценки иммуногенности одной из экспериментальных серий инактивированной вакцины от ЖЛ (№ 4) на мышах BALB/c в зависимости от вводимой дозы – количества общего белка.

В качестве положительного контроля использовали референс-сыворотку ВОЗ (YF): титр специфического IgG 1 : 25 600, титр в реакции нейтрализации – 1 : 160. Средний титр вируснейтрализующих антител против коммерческой живой вакцины от ЖЛ составил 1 : 20. Сыворотки мышей линии BALB/c, которым вводили ФСБ в качестве негативного контроля, отрицательны: титры IgG < 1 : 100; титры в реакции нейтрализации < 1 : 10).

Как следует из данных табл. 1, максимальные титры IgG и вируснейтрализующих антител соответствуют дозе общего белка 5,0 мкг / 0,1 мл, т. е. 50,0 мкг/мл или 25 мкг / 0,5 мл (принятый вводимый объём коммерческой живой вакцины от ЖЛ). Протективный вируснейтрализующий титр против вируса ЖЛ ≥ 1 : 10 [10].

В табл. 2 представлены результаты параллельного титрования (определение специфического IgG в ИФА) сывороток крови мышей линии BALB/c, иммунизированных лабораторной серией № 5 инактивированной вакцины от ЖЛ (5,0 мкг / 0,1 мл) и коммерческой живой вакциной против ЖЛ в предписанной для иммунизации людей дозе (3,2 lg БОЕ / 0,5 мл), но в объёме 0,1 мл на одну иммунизацию (или по общему белку примерно 50 мкг / 0,1 мл).

Из данных табл. 2 следует, что средний уровень титров специфического IgG в сыворотках крови мышей линии BALB/c после иммунизации лабораторной серией инактивированной вакцины против ЖЛ более чем в 2 раза выше титров IgG после иммунизации коммерческой живой вакциной против ЖЛ.

Таблица 1. Средние значения специфических титров IgG (ИФА) и вируснейтрализующих антител в сыворотках крови мышей линии BALB/c в зависимости от дозы вакцины
Table 1. The average values of specific titers of IgG (ELISA) and virus-neutralizing antibodies in sera of BALB/c mice depending on the vaccine dose

Таблица 2. Определение уровней специфических IgG (ИФА) в сыворотках крови мышей линии BALB/c, иммунизированных лабораторной серией инактивированной вакцины и коммерческой живой вакциной против жёлтой лихорадки (ЖЛ)
Table 2. Determination of specific IgG (ELISA) levels in sera of BALB/c miceimmunized with laboratory series of inactivated vaccine and commercial live vaccine against yellow fever (YF)

Обсуждение

Первые попытки создания инактивированной вакцины против ЖЛ были предприняты в 1928 г. (химически инактивированные суспензии селезёнки или печени обезьян, инфицированных диким типом вируса ЖЛ) и в 1935 г. (инактивированные нагреванием, ультрафиолетом или формалином суспензии мозга мышей, куриных эмбрионов, а также сыворотки мышей, инфицированных вирусом ЖЛ), однако они не увенчались успехом вследствие остаточной инфекционности либо низкой иммуногенности вакцинных препаратов [1]. С появлением живой вакцины на основе штамма 17D, которая широко используется до настоящего времени, интерес к разработке инактивированной вакцины резко снизился [1]. Достоинства и недостатки живой вакцины против ЖЛ хорошо изучены, однако новые исследования по разработке инактивированной вакцины против этого заболевания, причём на основе культур клеток, начались относительно недавно, примерно 10 лет назад [1][5][6]. Основная цель данных разработок – создание максимально безопасного вакцинного препарата, свободного от побочных нежелательных явлений, которые могут превышать пользу от самой вакцинации, особенно для детей в возрасте до 1 года и людей старше 60 лет [11]. Тенденция к отказу от живых вакцин в пользу инактивированных характерна для современной вакцинопрофилактики. В качестве примера можно привести разработку и внедрение инактивированной полиовирусной вакцины на основе штаммов Сэбина (С-ИПВ) взамен пероральной живой полиовирусной вакцины на основе этих же штаммов, которая с начала 1960-х годов доказала свою эффективность практически во всём мире, но продемонстрировала крайне нежелательные побочные эффекты и создала ряд серьёзных проблем масштабного характера (случаи вакциноассоциированного полиомиелита, формирование нейровирулентных вакцинородственных штаммов) [12].

Представленные в данном сообщении результаты по разработке инактивированной культуральной вакцины против ЖЛ демонстрируют эффективность данного препарата, по крайней мере на уровне оценки иммуногенности с использованием одной модели лабораторных животных – мышей BALB/c. Основываясь на работе T. Monath и соавт. [1], мы использовали и собственные методические подходы: концентрирование и очистку вируса ЖЛ, определение уровня специфического IgG в сыворотках крови иммунизированных животных (мышей BALB/c) и т.д. Высокая иммуногенность, присущая штамму 17D, которая обеспечила эффективность применения живой вакцины против ЖЛ в эндемичных регионах мира, позволила создать вакцинный препарат на лабораторном уровне с удовлетворительной иммуногенностью. Сравнительный анализ иммуногенности показал, что лабораторный вариант инактивированной вакцины против ЖЛ превосходит коммерческую живую вакцину против ЖЛ как по уровню индуцированных специфических антител класса G (IgG по данным ИФА), так и по уровню вируснейтрализующих антител. Это связано с высокой степенью очистки полученного вакцинного препарата по сравнению с коммерческой живой вакциной. Важно, что доза инактивированной вакцины по общему белку составляла не более 50 мкг/мл (или 5 мкг / 0,1 мл на одну иммунизацию), что в 10 раз меньше дозы по общему белку для живой коммерческой вакцины (примерно 50 мкг / 0,1 мл на одну иммунизацию) (см. табл. 1). Разумеется, одной лабораторной модели (мыши) недостаточно для завершения доклинических испытаний вакцины. Необходимы исследования иммуногенности с использованием других лабораторных животных, включая приматов [1][6].

Важно отметить, что культуральная высокоочищенная инактивированная вакцина против ЖЛ даже на лабораторном уровне существенно дороже живой вакцины, поскольку для её производства используются затратные и тонкие технологические подходы – культивирование вируса в культуре клеток, осветление и концентрирование вируссодержащей культуральной жидкости, инактивация вируса, хроматографическая очистка и т.д. Технология производства живой вакцины против ЖЛ значительно проще, а следовательно существенно дешевле. Однако оправданная тенденция к замене живой вакцины против ЖЛ инактивированной вакциной требует поиска компромисса между стоимостью вакцинного препарата и его безопасностью (по аналогии с живой полиовирусной вакциной на основе штаммов Сэбина и инактивированной полиовирусной вакциной).

Заключение

Таким образом, представленные результаты по разработке лабораторного варианта инактивированной культуральной вакцины против ЖЛ и оценка её иммуногенности с использованием типичной лабораторной модели (мыши BALB/c) продемонстрировали эффективность полученного препарата.

Об авторах

А. П. Иванов

ФГБНУ Федеральный научный центр исследований и разработки иммунобиологических препаратов им. М.П. Чумакова, РАН

Автор, ответственный за переписку.
Email: ivanovalexander1@gmail.com
ORCID iD: 0000-0003-4576-7136

Иванов Александр Петрович – доктор медицинских наук, ведущий научный сотрудник лаборатории молекулярной биологии вирусов.

108819, Москва Россия

Т. Д. Клеблеева

ФГБНУ Федеральный научный центр исследований и разработки иммунобиологических препаратов им. М.П. Чумакова, РАН

Email: fake@neicon.ru
ORCID iD: 0000-0003-4288-6818

Клеблеева Татьяна Дмитриевна – младший научный сотрудник лаборатории молекулярной биологии вирусов.

108819, Москва

Россия

Ю. В. Рогова

ФГБНУ Федеральный научный центр исследований и разработки иммунобиологических препаратов им. М.П. Чумакова, РАН

Email: fake@neicon.ru
ORCID iD: 0000-0002-4655-5330

Рогова Юлия Вячеславовна – руководитель отделения подопытных животных.

108819, Москва

Россия

О. Е. Иванова

ФГБНУ Федеральный научный центр исследований и разработки иммунобиологических препаратов им. М.П. Чумакова, РАН; ФГАОУ ВО Первый Московский государственный медицинский университет им. И.М. Сеченова Минздрава России (Сеченовский Университет)

Email: fake@neicon.ru
ORCID iD: 0000-0003-1784-4827

Иванова Ольга Евгеньевна – доктор медицинских наук, ведущий научный сотрудник лаборатории вирусологии полиомиелита и других энтеровирусных инфекций с Референс-центром ВОЗ по надзору за полиомиелитом ФГБНУ «ФНЦИРИП им. М.П. Чумакова РАН; профессор кафедры организации и технологии иммунобиологических препаратов Института трансляционной медицины и биотехнологии ФГАОУ ВО Первый МГМУ им. И.М. Сеченова.

108819, 11999, Москва

Россия

Список литературы

Дополнительные файлы