Сравнительный анализ критериев классификации ряда групп патогенных ДНК- и РНК-содержащих вирусов на основе геномных данных

Полный текст

Введение

Вирусы – это облигатные внутриклеточные паразиты, имеющие собственный геном, кодирующий структурные белки и ферменты, и способные реплицироваться только в чувствительных клетках [1].

В современной классификации вирусы представляют отдельный, но формально не выделенный аналог домена (domain) – Viruses, наряду с тремя главными доменами живой природы: археями (Archaea), бактериями (Bacteria) и эукариотами (Eukarya). Внутри домена Viruses вирусы объединены в 6 основных надцарств (realm), 10 царств (kingdom), 17 типов (phylum), 65 отрядов (order), 233 семейства (family) и 2606 родов (genus), включающих более 10 тыс. описанных видов (species). Внутри основных таксономических рангов используют промежуточные ранги, такие как подтип, подсемейство, подрод ¹. Концепция вида в вирусологии разрабатывалась с середины 1980-х гг. В настоящее время под видом вируса понимают монофилетическую группу вирусов, занимающих одну экологическую нишу. И эта группа может быть дифференцирована от родственных вирусов на основе серологических, генетических или филогенетических критериев.

Традиционные подходы идентификации и классификации вирусов основаны на антигенных связях и включают в себя серологические (реакция нейтрализации, реакция торможения гемагглютинации) и иммунохимические методы (иммуноферментный анализ, метод флуоресцирующих антител и др.). В основе данных методов лежит взаимодействие вирусов со специфическими антителами. Фактором, непосредственно влияющим на воспроизводимость полученных данных, является изменчивость поверхностных антигенов вирусов, которая обусловлена двумя генетическими процессами: дрейфом, не выводящим штамм вируса за пределы данного вида, и шифтом, определяющим изменения, приводящие к появлению нового вида вируса [2, 3], а также необходимостью использования стандартизованного антителосодержащего субстрата при строгом соблюдении принципа «единственного различия». Кроме того, достаточно сложно установить строгие количественные границы серологических различий при установлении видовой идентичности. Для идентификации и классификации вирусов на основе антигенных реакций используют стандартизованные панели сывороток и антигенов, которые хранятся в коллекциях вирусов. Минимальный порог кратности антигенных различий в перекрестной реакции, необходимый и достаточный для идентификации того или иного вируса в качестве самостоятельного вида, зависит не только от используемого серологического теста и конкретных методических особенностей его постановки, но и от таксономической принадлежности исследуемого изолята вируса и варианта сравнения.

Антигенные связи выявляются только внутри родственных групп вирусов, как правило, принадлежащих одному виду и роду. Для определения критериев более высоких таксономических рангов (семейство и выше) основное значение имеют тип и структура генома, структура вириона (тип симметрии нуклеокапсида, число капсомеров, наличие или отсутствие суперкапсида)¹.

В настоящее время одно из важнейших мест в диагностике инфекционных заболеваний занимают молекулярно-биологические и молекулярно-генетические методы, направленные на изучение особенностей генома. В диагностике вирусных инфекционных заболеваний наиболее часто используют выявление возбудителя с использованием полимеразной цепной реакции (ПЦР), ДНК-чипов, а также секвенирование геномных нуклеиновых кислот (НК). Для проведения секвенирования НК традиционно используют метод Сэнгера [цит. по 2]. В настоящее время широкое распространение получили технологии секвенирования нового поколения – массивное параллельное секвенирование [4] и нанопоровое секвенирование [5]. Последние модели автоматических секвенаторов позволяют при секвенировании получить значительный объем генетической информации. Внедрение методов секвенирования нового поколения приводит к упрощению процесса, уменьшению временных затрат (в первую очередь – на анализ результатов) и снижению его стоимости.

Анализ исследований в области молекулярной биологии и генетики вирусов, свидетельствует о широком внедрении в практику метода секвенирования для генотипирования возбудителей опасных и особо опасных вирусных инфекций. В настоящее время для каждого семейства определены свои критерии таксономии, которые могут быть основаны на определенном гене или группе генов, т.е. секвенирование геномных НК вирусов можно условно разделить на секвенирование по одному гену и секвенирование по всему геному. Выбор варианта секвенирования зависит от поставленных задач. Для классификации новых видов, как правило, требуется полногеномное секвенирование, при характеристике геновариантов внутри вида может быть использовано и секвенирование определенного гена. Результаты секвенирования могут быть использованы в качестве алгоритма определения места вновь выделенного изолята вируса в соответствующем таксоне семейства. В настоящее время разработан порядок применения молекулярно-биологических и молекулярно-генетических методов, основанный на структурированном подходе (алгоритме) индикации и генетической характеристике патогенного биологического агента. Обоснован трехуровневый алгоритм молекулярно-генетической характеристики патогенов (I уровень – выявление возбудителя с помощью ПЦР, II уровень – секвенирование фрагментов генома возбудителя, III уровень – проведение генотипирования [6].

Границы вида определяются критериями, принятыми Международным комитетом по таксономии вирусов (International Committee on Taxonomy of Viruses, ICTV) для данной группы вирусов. Молекулярно-биологический анализ геномной НК исследуемого возбудителя, основанный на данных секвенирования, позволит точно определить возможный уровень изменчивости внутри данного вида.

Возбудители особо опасных вирусных инфекционных заболеваний ‒ это вирусы, геном которых представлен двухцепочечной (ds)ДНК, либо одноцепочечной (ss)(+)РНК, либо одноцепочечной (ss)(−)РНК. Критерии определения до вида четко определены ICTV. Критерии выделения отдельных вирусов и их геновариантов, как правило, определяются исторической традиций для этой группы, при этом данные молекулярно-генетических исследований хорошо согласуются с результатами, полученными при использовании серологических тестов. Однако при использовании только данных секвенирования генома для разных групп вируса отсутствуют универсальные количественные критерии, четко определяющие таксономическую принадлежность исследуемого возбудителя.

Цель работы ‒ провести обзор и сравнительный анализ критериев, применяемых для идентификации и определения таксономической принадлежности ряда групп патогенных ДНК- и РНК-содержащих вирусов на основе геномных данных.

Вирусы, геном которых представлен dsДНК

Натуральная оспа – заболевание человека, характеризующееся высокой летальностью (30–50%), многочисленными, разнообразными и тяжелыми осложнениями. Восприимчивость человека к этой инфекции составляет более 95% [7–11].

В природе продолжают циркулировать ортопоксвирусы, в том числе и патогенные для человека: вирусы оспы обезьян, оспы коров, оспы буйволов. С прекращением вакцинации происходит снижение коллективного иммунитета, что позволяет распространяться в человеческой популяции патогенным для человека ортопоксвирусам. Скорость накопления мутаций в геноме ортопоксвирусов составляет 1 × 10⁶ нуклеотидных замен на сайт в год [12].

Геном ортопоксвирусов представлен линейной dsДНК размером 170–250 тыс. пар нуклеотидных остатков (п.н.о.) [13, 14]. Первые попытки установить эволюционную удаленность разных видов ортопоксвирусов были предприняты при помощи построения рестрикционных карт генома. Еще в конце прошлого века были построены рестрикционные карты геномов всех известных к тому времени представителей рода Orthopoxvirus. Такое картирование может служить критерием принадлежности исследуемого вируса к роду Orthopoxvirus, а внутри рода – критерием принадлежности к тому или иному виду. Однако при использовании данного метода нельзя установить, какой из видов является самым близким к наиболее общему предку и, соответственно, имеет больший эволюционный потенциал. Ответ на этот вопрос может дать секвенирование и изучение функционально-структурной организации генома исследуемого ортопоксвируса.

Полная структура генома вируса вакцины была определена в 1990 г. [13], вируса натуральной оспы – в 1992 г. [14]. Сравнительный анализ геномов вируса вакцины и вируса натуральной оспы позволил установить уровень изменчивости их генов. Установлено, что такие характеристики вируса вакцины и вируса натуральной оспы, как патогенность и круг восприимчивых хозяев, определяются разными наборами генов [14]. Это означает, что вирус натуральной оспы не мог произойти от вируса вакцины, а также вирус вакцины не мог произойти от вируса натуральной оспы. В то же время наличие выраженной гомологии в центральной области генома указывает на то, что эти вирусы имеют общего предшественника.

Сравнение нуклеотидных последовательностей вируса вакцины и вируса натуральной оспы указывает на то, что они имеют протяженные делеции относительно друг друга. Тот вирус, который при сравнении двух вирусов имеет наиболее протяженный геном, является эволюционно более близким к вирусу-предшественнику, что, как правило, подтверждается сравнением уровня гомологии наиболее консервативных генов. Из известных к настоящему времени ортопоксвирусов наиболее протяженным геномом и наиболее полным набором вирусных генов обладает вирус оспы коров [13, 15].

Для идентификации разных ортопоксвирусов использованы различные наборы генов. Описано использование для этой цели генов хемокинсвязывающего белка и α/β-интерферонсвязывающего белка, а также гена белка А27С, кодирующего консервативный белок вириона [12]. Для идентификации вновь выделяемых изолятов ортопоксвирусов как новых штаммов какого-либо идентифицированного вида или как представляющих отдельный самостоятельный вирус, перспективной является стратегия, предложенная G.L. Emerson и соавт. [16], предусматривающая анализ 9 открытых рамок считывания генома: A7L – ранний транскрипционный фактор, большая субъединица; A10L – основной центральный белок; A24R – РНК-полимераза 132; D1R – информационная РНК кэпирующего фермента, большая субъединица; D5R – ДНК-зависимая нуклеотидфосфатаза; E6R – гипотетический белок; E9L – ДНК-полимераза; H4L – белок, ассоциированный с РНК-полимеразой; J6R – РНК-полимераза 147.

Такой методический подход был использован для идентификации таксономической принадлежности недавно выявленных ортопоксвирусов: вирусов оспы кошек, Ахмета, Аляска. С этой целью было проведено выравнивание сцепленных геномных последовательностей ортопоксвирусов, представляющих Северную Америку и Старый Свет.

Данные сравнения геномных последовательностей 9 выбранных генов вируса оспы кошек (штамм Италия_09/17) с соответствующими геномными последовательностями для вирусов оспы кроликов, оспы обезьян, натуральной оспы, оспы коров, вакцины, эктромелии свидетельствуют о том, что вирус оспы кошек является отдаленно родственным по отношению к другим ортопоксвирусам, в том числе всем 10 линиям вируса оспы коров [17] и недавно выделенным сублиниям [18, 19]. При этом обнаружено более близкое родство с прототипным штаммом вируса эктромелии.

На филогенетическом дереве ортопоксвирусов штамм Италия_09/17 вируса оспы кошек формирует отдельный кластер, включающий также недавно выделенный от макак в Италии штамм Abatino. Нуклеотидная идентичность штамма Италия_09/17 и штамма Abatino составляет 99,66%, в то время как с референтными штаммами вируса эктромелии – 98,11–98,13%. По результатам анализа гена гемагглютинина, уровень идентичности штамма Италия_09/17 и штамма Abatino еще выше (99,79%) [20]. Следовательно, штаммы Италия_09/17 (выделенный от кошек) и Abatino (выделенный от макак) могут рассматриваться как штаммы одного нового ортопоксвируса Старого Света (вирус оспы кошек).

Изучение структуры генома вируса Ахмета показало наиболее высокую идентичность данного возбудителя с вирусом оспы коров. По сравнению с вирусом оспы коров, в центральной части генома вируса Ахмета отсутствовал только ген CPXV119A, кодирующий белок размером 80 аминокислотных остатков, в то время как он содержал малый ген AKMV059, отсутствующий у изолятов вируса оспы коров. Наибольший уровень геномных различий установлен по отношению к вирусу эктромелии, в центральном регионе которого отсутствуют 7 малых генов, выявленных в центральной части генома вируса Ахмета [21].

Филогенетический анализ перекрывающейся последовательности генома размером 28 037 п.н.о. выявил, что вирус Аляска (штамм AK2015) представляет собой отдельную генетическую линию ортопоксвирусов, которая значительно отличается как от североамериканских ортопоксвирусов (вирусы оспы енотов, оспы скунсов, оспы полевок) так и от ортопоксвирусов Старого Света (вирусы оспы верблюдов, оспы вакцины, оспы коров, эктромелии, Ахмета).

Вирус Аляска входит в монофилетическую кладу ортопоксвирусов Старого Света, уровень различия с отдельными видами которых составляет 6,1‒7,3%, соответствующий показатель при сравнении с североамериканскими ортопоксвирусами составляет 12,3‒12,8%. В этой связи следует отметить, что уровень генетических различий между сравниваемыми ортопоксвирусами Старого Света колеблется от 0,6% (в паре вирус оспы верблюдов – вирус оспы полевок) до 3,2% (в паре вирус эктромелии – вирус натуральной оспы) [18].

Рассмотренные данные позволяют установить видовую идентификацию вирусов Ахмета, Аляска и оспы кошек как отдельных представителей рода Orthopoxvirus.

Положение новых ортопоксвирусов на филогенетическом дереве ортопоксвирусов Старого Света, по результатам секвенирования генов A7L, A10L, A24R, D1R, D5R, E6R, E9L, H4L, J6R (имеющих близкие уровни консервативности) представлено на рисунке [18, 21, 22]. Результаты секвенирования геномов новых ортопоксвирусов позволяют предполагать возможность рекомбинации между ними и уже известными представителями рода, в результате которого возможно спонтанное появление варианта с повышенным уровнем патогенности для человека, вероятно, приближающемуся к таковому для вируса натуральной оспы.

 

Рисунок. Положение вирусов Ахмета, Аляска и оспы кошек на филогенетическом дереве ортопоксвирусов Старого Света

Figure. The position of the Alaska virus, the Akhmat virus and cat poxvirus on the phylogenetic tree of the Old World orthopoxviruses

 

На основании существующих критериев демаркации видов ортопоксвирусов¹ нами предложены следующие количественные показатели для проведения таксономической характеристики новых изолятов ортопоксвирусов (табл. 1). Необходимо отметить, что при проведении таксономической характеристики нами использованы данные частичного секвенирования генома. Результаты полногеномного секвенирования, безусловно, позволят уточнить предложенные количественные показатели, однако возможные изменения вряд ли будут носить кардинальный характер.

 

Таблица 1. Количественные показатели для проведения таксономической характеристики новых изолятов ортопоксвирусов при секвенировании по генам A7L, A10L, A24R, D1R, D5R, E6R, E9L, H4L, J6R

Table 1. The quantitative indicators for the taxonomic characterization of new isolates of orthopoxviruses based on A7L, A10L, A24R, D1R, D5R, E6R, E9L, H4L, J6R genes

Результаты секвенирования (уровень различий между сравниваемыми ортопоксвирусами), % Sequencing results (the level of differences between the compared orthopoxviruses) %	Вывод по результатам секвенирования Conclusion based on sequencing results
Менее 0,6 Less than 0.6	Сравниваемые ортопоксвирусы относятся к одному виду The orthopoxviruses being compared belong to the same species 0,6–3,2
0,6–3,2	Сравниваемые ортопоксвирусы относятся к разным видам монофилетической клады ортопоксвирусов Старого Света, за исключением вируса Аляска и вируса Ахмета The orthopoxviruses being compared belong to different species of a monophyletic clade of Old World orthopoxviruses, with the exception of the Alaska virus and the Akhmat virus
3,2–7,3	Сравниваемые ортопоксвирусы относятся к разным видам монофилетической клады ортопоксвирусов Старого Света The orthopoxviruses being compared belong to different species of a monophyletic clade of Old World orthopoxviruses
7,3–12,8	Сравниваемые ортопоксвирусы относятся к разным монофилетическим кладам (Старого и Нового Света) The orthopoxviruses being compared belong to different monophyletic clades of Old World orthopoxviruses and New World orthopoxviruses

 

Вирусы, геном которых представлен ss(+)РНК

Для анализа критериев идентификации видовой принадлежности РНК-содержащих вирусов этого класса по результатам секвенирования генома рассмотрены данные секвенирования представителей рода Alphavirus семейства Togaviridae – вирусов комплексов венесуэльского энцефаломиелита лошадей (ВЭЛ) и восточного энцефаломиелита лошадей (ВсЭЛ) и представителей рода Flavivirus семейства Flaviviridae – вирусов комплекса японского энцефалита.

Альфавирусы

Род Alphavirus семейства Togaviridae объединяет в настоящее время 34 самостоятельных вируса, разделенных на 7 антигенных комплексов (комплексы вируса Леса Барма, вируса ВсЭЛ, вируса Ндуму, вируса Леса Семлики, вируса ВЭЛ, вируса западного энцефаломиелита лошадей и неклассифицированные альфавирусы.

Строение генома альфавирусов выглядит следующим образом: «кэпированный» 5ʹ-конец, нетранслируемая область, гены неструктурных белков Nsp1, Nsp2, Nsp3, Nsp4, 26S; РНК, содержащая гены структурных белков, нетранслируемая область, поли-А последовательность на 3ʹ-конце. Общий размер генома составляет около 12 тыс. нуклеотидов [23–26]. Расчетная скорость мутаций (которые потенциально могут привести к появлению вирулентных для человека природных штаммов) для геномов указанных альфавирусов составляет приблизительно 1,0 × 10⁻⁴ нуклеотидных замен в соответствующих позициях генома в год [27].

В комплекс ВЭЛ входят альфавирусы со схожими генетическими характеристиками и перекрестной антигенной активностью [28]. Альфавирусы являются ре-эмерджентными арбовирусами, вызывающими эпизоотии лошадей и вспышки заболеваний человека [29]. Комплекс ВЭЛ разделяется на 6 подтипов (I–VI), в которые входят 9 вирусов [30], наибольшее значение для здравоохранения и ветеринарии имеет вирус ВЭЛ.

Филогенетический анализ вирусов комплекса ВЭЛ основан на определении нуклеотидной последовательности генов структурных белков [24, 26, 31, 32]. N.L. Forrester и соавт. [28] провели анализ комплекса ВЭЛ с помощью секвенирования геномов 94 штаммов вирусов с последующим филогенетическим анализом при использовании открытых рамок считывания для структурных и неструктурных белков. Результаты анализа показали, что селекция является основным фактором эволюции этих возбудителей, а также определяющим механизмом молекулярных часов датирования наиболее позднего общего предка, которое для подтипов ID/IAB/IC/I II и IE составляет 149–973 года. IE-подтип комплекса ВЭЛ характеризует значительный эволюционный сдвиг. Увеличение количества аминокислотных замен в структурных белках является уникальным для этого подтипа, что отражает адаптацию возбудителя к уникальному вектору – комарам Culex taeniopus.

Проведенные исследования позволили подтвердить гипотезу, согласно которой подтипы IAB и IC произошли от энзоотического подтипа ID вследствие мутаций, что привело к изменению их эпидемических и эпизоотических характеристик [26, 32–35]. Деление внутри комплекса на подтипы I–VI ранее было проведено по результатам серологических тестов. Однако дифференциация между субтипами A–F антигенного подтипа I при использовании только серологических тестов невозможна [36–38]. Результаты секвенирования геномной РНК могут внести изменения в существующую в настоящее время таксономическую номенклатуру, в результате чего некоторые штаммы возбудителя ВЭЛ сейчас классифицируют как отдельные самостоятельные вирусы. Например, подтип IF существенно отличается от других субтипов подтипа I и в настоящее время рассматривается не как штамм вируса ВЭЛ, а как отдельный возбудитель (вирус Mosso das Pedras).

До относительно недавнего времени вирус ВсЭЛ рассматривался как единственный представитель одноименного комплекса. Однако в результате проведенных в последнее время генетических исследований представители южноамериканского подтипа возбудителя ВсЭЛ рассматриваются в качестве отдельных штаммов самостоятельного вируса, получившего название вирус Мадариага [39]. Установлены различия вируса Мадариага с возбудителем ВсЭЛ, циркулирующим в Северной Америке.

Согласно классификации, предложенной N.C. Arrigo и соавт. [27], североамериканский подтип вируса ВсЭЛ образует одну генетическую линию комплекса ВсЭЛ (линия I). Эта линия включает штаммы вируса ВсЭЛ из Северной Америки. Южноамериканский подтип вируса ВСЭЛ, или вирус Мадариага, разделен на линии II, III и IV.

Филогенетический анализ, проведенный с помощью программы MUSCLE [40], выявил, что штаммы, выделенные от больных на Гаити, относятся к линии III, которая представляет изоляты из Центральной и Южной Америки и изоляты из Центральной Америки, формирующие Центральноамериканскую Карибскую монофилетическую сублинию. Время появления наиболее позднего общего предка для этой сублинии 1939 г. (I₉₅ – 1931–1948 гг.). В пределах данной сублинии новые изоляты из Гаитянского кластера близки к изолятам, выделенным в Панаме. Оцениваемая скорость эволюции составляет 1,2 × 10⁻⁴ нуклеотидных замен в год [27].

Количественные показатели для проведения таксономической характеристики новых изолятов вирусов комплексов ВЭЛ и ВсЭЛ по результатам секвенирования геномной РНК представлены в табл. 2.

 

Таблица 2. Количественные показатели для проведения таксономической характеристики новых изолятов вирусов комплексов ВЭЛ и ВсЭЛ по результатам секвенирования геномной РНК

Table 2. The quantitative indicators for the taxonomic characterization of new isolates of VEE and EEE virus complexes based on data of sequencing of genomic RNA

Результат секвенирования (уровень различий между сравниваемыми альфавирусами), % Sequencing result (the level of differences between the compared alphaviruses), %	Вывод по результатам секвенирования Conclusion based on sequencing result
Менее 0,1 Less than 0.1	Сравниваемые изоляты вирусов относятся к одному генотипу определенного субтипа The compared virus isolates belong to the same genotype of a certain subtype
0,1–0,3	Сравниваемые изоляты вирусов относятся к одному субтипу определенного подтипа The compared virus isolates belong to the same genotype of a certain type
0,3–2,3	Сравниваемые изоляты вирусов относятся к разным подтипам комплекса The compared virus isolates belong to different subtypes of complex
Более 2,3 More than 2.3	Сравниваемые изоляты вирусов относятся к разным комплексам рода Alphavirus The compared virus isolates belong to different complexes of Alphavirus genus

 

Флавивирусы

Представители рода Flavivirus – это возбудители, геном которых представлен ss(+)РНК, содержащей 7-метилгуанозиновый кэп на 5ʹ-конце. Геномная РНК размером около 11 тыс. нуклеотидных остатков (н.о.) содержит одну открытую рамку считывания, которая фланкирована 5ʹ-концевым кэпированным некодирующим регионом и 3ʹ-концевым некодирующим регионом, совместно формирующими петлевидную структуру, необходимую для вирусной репликации и трансляции, и содержит детерминанты, определяющие патогенность возбудителя [41].

Открытая рамка считывания флавивирусов кодирует 10 белков, включающих 3 структурных (белок нуклеокапсида (С), трансмембранный белок (prM) и белок оболочки (Е)), а также 7 неструктурных (NS1, NS2a, NS2b, NS3, NS4a, NS4b и NS5) белков [41].

Род Flavivius (семейство Flaviviridae) разделяется по меньшей мере на 14 групп, это деление базируется на данных анализа нуклеотидного состава геномных РНК и рассчитанных на его основе аминокислотных последовательностях структурных белков, антигенному родству и другим характеристикам [41].

Двумя близкородственными группами внутри рода Flavivirus являются группы вирусов Нтайя и японского энцефалита.

Группа японского энцефалита, кроме одноименного вируса, включает такие возбудители инфекционных заболеваний человека, как вирусы энцефалита Долины Мюррея, энцефалита Сан-Луи, Западного Нила, денге, желтой лихорадки. Группа Нтайя включает, в частности, вирусы Ильеус, Росио и Зика¹.

Минимальный порог кратности антигенных различий в перекрестной реакции, необходимый и достаточный для идентификации того или иного флавивируса в качестве самостоятельного вида, составляет более 4 [42]. По результатам секвенирования геномной РНК пороговое значение, указывающее на принадлежность 2 сравниваемых флавивирусов к одному виду, должно быть более 84% [43].

Установление таксономической принадлежности вновь выделяемых флавивирусов будет рассмотрено на примере вируса Росио, который ранее был классифицирован как подтип вируса Ильеус [44]. Вирус Росио впервые был выделен в штате Сан-Пауло (Бразилия) в 1975 г. от человека, погибшего от энцефалита неизвестной этимологии [45]. Летальность среди заболевших превышает 10% [46, 47].

Организация геномной РНК вируса Росио (с указанием генов структурных и неструктурных белков) представлена в табл. 3.

 

Таблица 3. Организация геномной РНК вируса Росио [48]

Table 3. The organization of the genomic RNA of the Rocio virus [48]

Вирусспецифические белки Viral proteins	Участки генома Genome regions	Размер (н.о.) Size (nt)	Позиции генома Position in genome
5’- и 3’-нетранслируемые участки 5’ and 3’ untranslated regions	5ʹНКР	92	1–92
	3ʹHKP	424	10 371–10 794
Структурные белки Structural proteins	С	354	93–446
	p2M	501	447–947
	E	1503	948–2450
Неструктурные белки Nonstructural proteins	NS1	1059	2451–3509
	NS2A	681	3510–4190
	NS2B	393	4191–4583
	NS3	1857	4584–6440
	NS4A	378	6441–6818
	2K	69	6819–6887
	NS4B	768	6888–7655
	NS5	2715	7656–10 370

Примечание. НКР – некодируемый регион.

Note. NCR – noncoding region.

 

Для установления таксономического родства вируса Росио с другими флавивирусами достаточно использовать данные секвенирования гена белка NS5 размером 1358 нуклеотидов.

Уровень гомологии указанного участка по сравнению с вирусом Ильеус составляет 81,9%, с вирусом Зика – 78,3%, с вирусом японского энцефалита – 64,5%, с вирусом Западного Нила – 65,0%, с вирусом энцефалита долины Муррея – 64,7%, с вирусом энцефалита Сан-Луи – 66,1% [41, 48–50].

Полученные данные дают основания для проведения таксономической характеристики новых изолятов флавивирусов по результатам частичного секвенирования геномной РНК (по гену белка NS5). Результаты представлены в табл. 4.

 

Таблица 4. Количественные показатели для проведения таксономической характеристики новых изолятов флавивирусов по результатам секвенирования геномной РНК (по гену белка NS5) (вид-вирус – генотип-штамм)

Table 4. Quantitative indicators for the taxonomic characterization of new isolates flaviviruses based on data of sequencing of genomic RNA (the NS5 protein coding region) (virus species–genotype-strain)

Результаты секвенирования (уровень различий между сравниваемыми флавивирусами), % Sequencing results (the level of differences between the compared flaviviruses), %	Вывод по результатам секвенирования Conclusion based on sequencing results
Менее 16 Less than 16	Сравниваемые изоляты вирусов относятся к одному и тому же виду флавивирусов The compared virus isolates belong to same flaviviruses species
16–25	Сравниваемые изоляты вирусов представляют разные виды, относящихся к одной и той же группе флавивирусов The compared virus isolates represent different species belonging to the same group of flaviviruses
25–36	Сравниваемые изоляты вирусов относятся к разным группам флавивирусов The compared virus isolates represent different group of flaviviruses
Более 36 More than 36	Если один из сравниваемых изолятов идентифицирован как относящийся к роду Flavivius, другой не является членом данного рода The one of the compared isolates is identified as member of Flavivius genus, while the other is not a member of this genus

 

Вирусы, геном которых представлен ss(-)РНК

При анализе этого класса рассмотрены группы вирусов с несегментированным (на примере представителей семейства Filoviridae порядка Mononegavirales) и сегментированным геномами (на примере представителей семейств Arenaviridae и Phenuiviridae порядка Bunyavirales).

Филовирусы

Таксономия семейства Filoviridae в последние десятилетия претерпела существенные изменения. Еще в конце прошлого века в это семейство входил единственный род – Filovirus, который включал вирусы Марбург и Эбола [51]. Внедрение в практику вирусологических исследований методов молекулярной биологии и молекулярной генетики привело к существенному изменению таксономии семейства Filoviridae. На родовом уровне сначала род Filovirus был разделен на роды Marburgvirus и Ebolavirus (в настоящее время получившие названия Orthomarburgvirus и Orthoebolavirus) [52]. В дальнейшем был идентифицирован ряд новых филовирусов, представляющих самостоятельные роды Cuevavirus, Dianlovirus, Striavirus, Thamnovirus [53, 54].

Вирус Эбола – общее название вирусов, относящихся к роду Orthoebolavirus семейства Filoviridae. На уровне вида вирусов сначала вирус Эбола был разделен на вирусы Эбола-Заир (по бинарной номенклатуре – Orthoebolavirus zairense) и Эбола-Судан (Orthoebolavirus sudaense), рассматриваемых ранее как подтипы одного возбудителя. Затем в качестве отдельных вирусов были идентифицированы патогенные для человека вирусы Эбола-Таи Форест (Orthoebolavirus taiense) [55] и Эбола-Бундибуджио (Orthoebolavirus bundibudgioense) [56], патогенный для приматов вирус Эбола-Рестон (Orthoebolavirus restonense) [57] и вирус Бомбали (Orthoebolavirus bombaliense), патогенность которого для каких-либо животных в настоящее время не определена [58, 59].

Таким образом, из 6 видов вируса Эбола 3 вида вызывают у человека заболевание с высокой летальностью: Эбола-Заир – летальность 50–90%, Эбола-Судан – около 50% и Эбола-Бундибуджио – около 30%.

В семейство Orthomarburgvirus ранее входил один вид – вирус Марбург. Вирус Ravn, в настоящее время рассматриваемый в качестве самостоятельного вируса, сначала считали отдельным штаммом вируса Марбург [60].

Рассмотрим экспериментальные данные секвенирования геномов, которые легли в основу изменения таксономии семейства Filoviridae.

С целью филогенетического анализа представителей семейства Filoviridae S.A. Carroll и соавт. [61] провели детальный анализ 97 полногеномных нуклеотидных последовательностей, из которых 55 установлены после 2010 г. С помощью байесовского анализа авторы определили скорость эволюции и предполагаемое время происхождения филовирусов от общего предка. Рассмотрим результаты секвенирования для отдельных филовирусов.

Вирус Эбола-Заир

При анализе 22 полногеномных последовательностей, включающих образцы, взятые в разных регионах, выявлено, что генетическое разнообразие между штаммами вируса Эбола-Заир незначительное, максимальное различие между нуклеотидными последовательностями составляет 2,7%. У штаммов, выделенных в ходе одной вспышки, уровень различий еще ниже. Например, различия в нуклеотидных последовательностях изолятов выделенных в Луэбо (Демократическая Республика Конго) во время вспышки 2007–2008 гг., были менее 0,07% [61, 62].

Вирус Эбола-Судан

По сравнению с вирусом Эбола-Заир вирус Эбола-Судан имеет более ограниченное географическое происхождение, все 5 известных вспышек к настоящему времени произошли в районе протяженностью не более 560 км, что предположительно отражает ограниченное распределение природного резервуара или другие экологические ограничения. По вирусу Эбола-Судан проанализировано 5 полногеномных последовательностей, по одной из каждой вспышки. Результаты полногеномного секвенирования штаммов вируса Эбола-Судан показали, что в целом изменчивость вирусов внутри вида низкая, максимальное количество нуклеотидных замен (5,2%) установлено между изолятами из Судана, выделенными в 2004 г., и Уганды в 2011 г. [61, 62].

Вирус Эбола-Рестон

Проанализированы 7 полногеномных последовательностей изолятов вируса Эбола-Рестон, выделенных во время вспышек у низших приматов (Рестон, Пенсильвания, США) и в 1996 г. (Техас, США), на Филиппинах в 1989 г. и 2008–2009 гг. от свиней [57, 59]. Полученные данные показали влияние на генетическую изменчивость как временны́х, так и пространственных факторов. Оцениваемый уровень генетической изменчивости между различными выделенными изолятами составлял от 0,08 до 4,5% [61].

Вирус Марбург

Исследовано 60 последовательностей 48 изолятов от человека и 12 изолятов от летучих мышей. Полученные результаты показали, что уровень генетической изменчивости между штаммами вируса Марбург не превышает 4,6%. Уровень генетической изменчивости между вирусами Марбург и Ravn составил около 20% [60].

Для оценки влияния данных секвенирования геномов на таксономию семейства Filoviridae целесообразно рассмотреть соответствующие результаты для выявленных в последнее время филовирусов. Так, для вируса Бомбали, уровень генетической изменчивости которого от вируса Эбола-Заир составляет около 18%, отмечен высокий уровень идентичности геномов (98%) штаммов из Сьерра-Леоне и Кении [58]. При секвенировании вируса Ллови (род Cuevavirus) установлено, что по первичной структуре последовательности геномной РНК вирус на 57,3–57,7% отличается от вируса Марбург и на 51,8–52,6% от вируса Эбола-Заир [63].

При секвенировании вируса Менгла (род Dianlovirus) по фрагменту гена нуклеопротеина установлена 74% идентичность по отношению к вирусу Ллови, по фрагменту гена VP35 (69% идентичность по отношению к вирусу Эбола-Судан, по фрагменту гена РНК-зависимой РНК-полимеразы – 66–68% для членов рода Ebolavirus, 64% идентичность с вирусом Ллови и около 60% с вирусом Марбург [64].

На основании рассмотренных данных можно предложить следующие количественные показатели для проведения таксономической характеристики новых изолятов филовирусов по результатам полного или частичного (по гену белка L) секвенирования геномной РНК. Результаты представлены в табл. 5.

 

Таблица 5. Количественные показатели для проведения таксономической характеристики новых изолятов филовирусов по результатам секвенирования геномной РНК (по гену белка L)

Table 5. Quantitative indicators for the taxonomic characterization of new isolates of filoviruses based on data of sequencing of genomic RNA (L protein gene)

Результаты секвенирования (уровень различий между сравниваемыми филовирусами), % Sequencing results (the level of differences between the compared filoviruses), %	Вывод по результатам секвенирования Conclusion based on sequencing results
Менее 4,5 Less than 4.5	Сравниваемые изоляты вирусов относятся к одному и тому же виду филовирусов The compared virus isolates belong to same filovirus species
4,5–20	Сравниваемые изоляты вирусов предположительно представляют разные виды, относящихся к одному и тому же роду филовирусов The compared virus isolates presumably represent different species, belonging to the same genus of filoviruses
20–35	Сравниваемые изоляты вирусов представляют разные виды, которые предположительно могут относиться к одному и тому же роду филовирусов The compared virus isolates represent different species, presumably belonging to the same genus of filoviruses
Более 35 More than 35	Сравниваемые изоляты вирусов представляют разные роды семейства Filoviridae The compared virus isolates represent different genus of Filoviridae family

 

Аренавирусы

Семействo Arenaviridae представляет собой большую группу РНК-содержащих вирусов, геномная РНК которых состоит из двух сегментов и обладает амбисенсной стратегией кодирования. Аренавирусы разделяют на аренавирусы Старого и Нового Света. Это разделение основано на серологических и филогенетических критериях, а также на географическом положении эндемичных регионов.

В семейство Arenaviridae входит один род (Arenavirus), который включает 24 вируса [65].

Геном аренавирусов состоит из ss(−)РНК, включающей большой (L) и малый (S) сегменты. L-сегмент (размер приблизительно 7,1 тыс. н.о.) кодирует вирусную РНК-зависимую РНК-полимеразу (L) и цинксвязывающий белок (Z). S-сегмент (размер приблизительно 3,4 тыс. н.о.) кодирует белок нуклеокапсида (N) и предшественника оболочечного гликопротеина, который в ходе онтогенеза расщепляется на гликопротеины G1 и G2 (GPC) [66].

При оценке влияния результатов секвенирования геномной РНК аренавирусов на таксономию представителей этого семейства целесообразно отдельно рассмотреть данные, полученные при секвенировании геномной РНК аренавирусов Старого (вирус Ласса) и Нового Света. Это обусловлено тем, что южноамериканские аренавирусные геморрагические лихорадки, в отличие от лихорадки Ласса, обладают выраженными природными очагами, выход за пределы которых в естественных условиях является маловероятным событием.

Штаммы вируса Ласса по результатам секвенирования геномной РНК первоначально были распределены на 4 генетические линии, в дальнейшем были установлены еще 2 генетические линии, хотя ICTV они официально еще не признаны [67, 68]. Линии 1–3 выделены только в Нигерии, в то время как линия 4 выделена в разных странах Западной Африки. Результаты секвенирования геномной РНК показали высокий уровень генетической изменчивости между линиями 1–4 (до 27% по нуклеотидной последовательности). Необходимо отметить, что различия по нуклеотидному составу гена гликопротеина для разных генетических линий вируса Ласса ниже, чем для гена белка нуклеокапсида.

При сравнении нуклеотидных последовательностей штаммов вируса Ласса установлено, что последовательности штаммов, относящихся к одному и тому же географическому региону, являются очень сходными (уровень идентичности более 99%). При сравнении штаммов вируса Ласса из разных регионов установлена значительная вариабельность, причем для генов белков L и Z более высокая (до 26%), чем для генов белков GPC и N.

Филогенетический анализ аренавирусов Нового Света базируется на секвенировании гена белка нуклеокапсида, по результатам которого проведено разделение вирусов, входящих в данную группу, на три клады (А, В и С). Возбудители особо опасных аренавирусных геморрагических лихорадок (аргентинской, боливийской, бразильской и венесуэльской) – вирусы Хунин, Мачупо, Сэбиа и Гуанарито соответственно, относятся к кладе В. Уровень генетической изменчивости по гену белка нуклеокапсида для разных штаммов одного и того же возбудителя не превышает 5%, в то время как аналогичный показатель при сравнении разных аренавирусов Нового Света, входящих в одну кладу, превышает 40%, а в разные клады – 60% [69].

Рассмотренные данные могут быть использованы для определения количественных показателей при проведении таксономической характеристики новых изолятов аренавирусов Старого (по результатам секвенирования по гену белка L) и Нового Света (по результатам секвенирования по гену белка N). Результаты представлены в табл. 6.

 

Таблица 6. Количественные показатели для проведения таксономической характеристики новых изолятов аренавирусов по результатам секвенирования геномной РНК

Table 6. Quantitative indicators for the taxonomic characterization of new arenavirus isolates based on data of sequencing of genomic RNA

Группа аренавирусов Group of arenaviruses	Область секвенирования Sequencing region	Результаты секвенирования (уровень различий между сравниваемыми аренавирусами), % Sequencing results (the level of differences between the compared arenaviruses), %	Вывод по результатам секвенирования Conclusion based on sequencing results
Старого Света (на примере вируса Ласса) Old World arenaviruses (Lassa virus as example)	Ген белка L L-protein gene	Менее 1 Less than 1	Сравниваемые изоляты относятся к одной и той же генетической линии вируса. Вероятно, что сравниваемые штаммы выделены в одном и том же регионе The compared isolates belong to the same genetic lineage of the virus. It is likely that the compared strains were isolated in the same region
		1–2	Сравниваемые изоляты относятся к одной и той же генетической линии вируса The compared isolates belong to the same genetic lineage of the virus
		2–26	Сравниваемые изоляты относятся к разным генетическим линиям вируса The compared isolates belong to the different genetic lineages of the virus
		Более 26 More than 26	Сравниваемые изоляты представляют разные вирусы The compared isolates represent different viruses
Нового Света (на примере вируса Мачупо) New World arenaviruses (Machupo virus as example)	Ген белка N N-protein gene	Менее 5 Less than 5	Сравниваемые изоляты представляют разные штаммы вируса, относящиеся к одной и той же генетической линии The compared isolates belong to the same genetic lineage of the virus
		5–40	Сравниваемые изоляты представляют разные вирусы, входящие в одну и ту же кладу The compared isolates represent different viruses from the same clade
		Более 40 More than 40	Сравниваемые изоляты представляют разные вирусы, входящие в разные клады The compared isolates represent different viruses from different clades

 

Бандавирусы

Геном бандавирусов, как и других представителей семейства Phenuiviridae, состоит из 3 сегментов (L, M и S) (−)РНК. L-сегмент генома (≈ 6400 н.о.) содержит одну открытую рамку считывания, кодирующую РНК-зависимую РНК-полимеразу. M-сегмент генома (≈ 3400 н.о.) содержит одну открытую рамку считывания, кодирующую предшественника гликопротеинов (Gn и Gc). S-сегмент, содержащий 1744 н.о., имеет амбисенсную организацию, кодирует белок N в антисмысловой ориентации и вирусный неструктурный белок (Nss) в смысловой ориентации [70, 71].

Влияние результатов секвенирования геномной РНК бандавирусов на таксономию этой группы рассмотрено на примере нового вируса Даби (возбудитель острой лихорадки с тромбоцитопеническим синдромом (SFTS)), относящегося к роду Bandavirus семейства Phenuiviridae.

Филогенетический анализ, проведенный с помощью определения полноразмерных последовательностей сегментов L, M и S вируса Даби, установил, что данный возбудитель занимает промежуточное положение между двумя другими группами рода Bandavirus (группа Сицилийской москитной лихорадки и группа вируса Уукуниеми), т.е. представляет новую группу рода Bandavirus [72–75].

В ходе проведения секвенирования геномной РНК выявлено 6 генотипов возбудителя SFTS (А, В, С, D, Е и F). Уровень генетических различий вируса Даби и других бандавирусов в значительной степени различается при сравнении по разным генам. Уровень гомологии вирусов Даби н Уукуниеми по сегментам L, M и S геномной РНК составляет 34, 24 и 29% соответственно. Наиболее уникальной структурой характеризуется ген белка NSs, для которого уровень гомологии с другими флебовирусами составляет от 11,2 до 16,0% [76]. В то же время уровень гомологии по сегментам L, M и S различных генотипов возбудителя SFTS составлял 95,8–99,8, 94,1–99,9 и 94,8–99,7% соответственно [76, 77].

Для проведения таксономической оценки изолятов вируса SFTS достаточно использовать данные секвенирования гена белка L. Количественные показатели, которые можно использовать при проведении таксономической характеристики вновь выделенных изолятов вируса SFTS, представлены в табл. 7.

 

Таблица 7. Количественные показатели для проведения таксономической характеристики новых изолятов вируса Даби по результатам секвенирования по гену белка L

Table 7. Quantitative indicators for the taxonomic characterization of new isolates of Daby virus based on data of sequencing of genomic RNA (L protein gene)

Результаты секвенирования (уровень различий между сравниваемыми филовирусами), % Sequencing results (the level of differences between the compared isolates), %	Вывод по результатам секвенирования Conclusion based on sequencing results
Менее 0,2 Less than 0.2	Сравниваемые изоляты вирусов относятся к одному и тому же генотипу вируса The compared isolates belong to the same genotype of the virus
0,2–4,2	Сравниваемые изоляты вирусов относятся к разным генотипам вируса The compared isolates belong to the different genotypes of the virus
4,2–31	Сравниваемые изоляты вирусов представляют разные виды, которые предположительно могут относиться одной и той же группе рода Bandavirus The compared virus isolates represent different species, which presumably may belong to the same group within genus Bandavirus
Более 35 More than 35	Сравниваемые изоляты вирусов представляют разные группы рода Bandavirus The compared virus isolates represent different groups within genus Bandavirus

 

Таким образом, даже результаты частичного секвенирования геномной НК вносят существенный вклад при проведении таксономической характеристики вновь выявляемых ДНК- и РНК-содержащих вирусов. Ввиду недостаточности таксономической идентификации с использованием серологических методов, данные секвенирования геномной НК должны занять приоритетное положение.

ICTV активно использует для классификации данные секвенирования геномов возбудителей. Согласно установленным требованиям, главным критерием для идентификации вида вируса является идентичность последовательности нуклеотидов свыше 90% [78]. Однако вместе с тем в настоящее время находит широкое применение также метод идентификации вида вируса с использованием короткого участка генома, определенного гена или нескольких генов. Важно отметить, что не только для каждого класса вирусов, но и для таксонов более низкого уровня при проведении частичного секвенирования с целью таксономической идентификации вновь выделенного изолята возбудителя необходимы обоснованный выбор участка генома для секвенирования и определение количественных критериев, позволяющих проводить идентификацию. Разный уровень количественных показателей для ДНК- и РНК-содержащих вирусов определяют различия в скорости эволюции, которая для РНК-содержащих вирусов в среднем на 2 порядка выше (1 × 10⁻⁶ и 1 × 10⁻⁶ нуклеотидных замен на сайт в год соответственно). С целью таксономической идентификации вновь выделенного изолята вируса с помощью секвенирования необходимо проведение сравнительной оценки с охарактеризованным штаммом возбудителя. При этом высшим таксономическим уровнем, в пределах которого должны находиться анализируемый изолят возбудителя и вариант сравнения, является род вирусов.

Финансирование. Авторы заявляют об отсутствии внешнего финансирования при проведении исследования.

Конфликт интересов. Авторы декларируют отсутствие явных и потенциальных конфликтов интересов, связанных с публикацией настоящей статьи.

Funding. This study was not supported by any external sources of funding.

Conflict of interest. The authors declare no apparent or potential conflicts of interest related to the publication of this article.

¹ ICTV. Current ICTV Taxonomy Release. Available at: http://talk.ictvonline.org/taxonomy/

Об авторах

Татьяна Евгеньевна Сизикова

ФГБУ «48 Центральный научно-исследовательский институт» Минобороны России

Email: 48cnii@mil.ru
ORCID iD: 0000-0002-1817-0126

канд. биол. наук, старший научный сотрудник

Россия, Сергиев Посад

Виталий Николаевич Лебедев

ФГБУ «48 Центральный научно-исследовательский институт» Минобороны России

Email: 48cnii@mil.ru
ORCID iD: 0000-0002-6552-4599

д-р биол. наук, профессор, ведущий научный сотрудник

Россия, Сергиев Посад

Сергей Владимирович Борисевич

ФГБУ «48 Центральный научно-исследовательский институт» Минобороны России

Автор, ответственный за переписку.
Email: 48cnii@mil.ru
ORCID iD: 0000-0002-6742-3919

д-р биол. наук, профессор, академик РАН РФ, начальник института

Россия, Сергиев Посад

Список литературы

Дополнительные файлы