Immune reactivity of two biological models to vaccination with inactivated vaccine QazVac against coronavirus infection COVID-19

Balzhan Sh. Myrzakhmetova; Мырзахметова Балжан Шайзадаевна; Gulzhan A. Zhapparova; Жаппарова Гульжан Амировна; Karina B. Bisenbayeva; Бисенбаева Карина Бисенбаевна; Aizhan S. Toytanova; Тойтанова Айжан Сейткаримовна; Moldir S. Tuyskanova; Туысканова Молдир Сежанкызы; Kuandyk D. Zhugunissov; Жугунисов Куандык Даулетбаевич; Lespek B. Kutumbetov; Кутумбетов Леспек Бекболатович

doi:10.36233/0507-4088-222

Иммунная реактивность двух биологических моделей на прививку инактивированной вакциной QazVac против коронавирусной инфекции COVID-19

Авторы: Мырзахметова Б.Ш.¹, Жаппарова Г.А.¹, Бисенбаева К.Б.¹, Тойтанова А.С.¹, Туысканова М.С.¹, Жугунисов К.Д.¹, Кутумбетов Л.Б.¹
Учреждения:
1. РГП «Научно-исследовательский институт проблем биологической безопасности» МЗ РК
Выпуск: Том 69, № 3 (2024)
Страницы: 219-230
Раздел: ОРИГИНАЛЬНЫЕ ИССЛЕДОВАНИЯ
Дата подачи: 30.01.2024
Дата публикации: 05.07.2024
URL: https://virusjour.crie.ru/jour/article/view/16611
DOI: https://doi.org/10.36233/0507-4088-222
EDN: https://elibrary.ru/mcackf
ID: 16611

Цитировать

Полный текст

Аннотация
Полный текст
Об авторах
Список литературы
Дополнительные файлы
Статистика

Аннотация

Введение. Специфическая профилактика ряда инфекционных болезней введена в календарь медицинских прививок. Производство иммунопрофилактических препаратов в целях установления стандартных свойств, в том числе по безопасности и специфической эффективности, требует строгого соблюдения регламента изготовления, а достоверность полученных результатов – проведения контроля указанных параметров. Специфическую эффективность вакцинных препаратов стандартизируют по показателям стимуляции гуморальных факторов иммунитета, формируемых в организме привитых модельных биологических объектов.

Цель работы. Определение иммунной реактивности белых мышей на прививку вакциной QazVac для установления возможности их использования в качестве биологической модели в оценке иммуногенности вакцины вместо сирийских хомяков.

Материалы и методы. Оценку иммунной реактивности модельных животных проводили по количеству сероконверсивности, скорости и динамике титров антител на вирус SARS-CoV-2, формируемых в организме после прививки испытуемой вакциной.

Результаты. Результаты исследований показали, что испытуемые биологические модели обладают примерно одинаковой иммунной реактивностью на введение вакцины QazVac, подтверждающим свидетельством которой являлись уровень и динамика титров антител. При анализе кратности увеличения титров антител в сравнении с таковыми контрольных животных, сирийские хомяки обладают сравнительно большей реактивностью. Но белые мыши, свободные от патогенной микрофлоры (СПФ), стандартны по интактности от антител на вирус SARS-CoV-2.

Заключение. Полученные данные свидетельствует о том, что иммунная реактивность белых мышей на введение вакцины QazVac по скорости и динамике формирования вируснейтрализующих антител является практически равнозначной иммунной реактивности сирийских хомяков. В организме белых мышей категории СПФ до прививки вакциной, в отличие от сирийских хомяков, не содержатся факторы гуморального иммунитета, специфичные к вирусу SARS-CoV-2.

Ключевые слова

иммунная реактивность, вирус SARS-CoV-2, реакция нейтрализации, вакцина

Полный текст

Введение

Эффективным способом профилактики инфекционных заболеваний и ликвидации их эпидемического распространения является повышение иммунной защиты организма с помощью вакцинных препаратов [1–10]. Так, для предупреждения случаев заболевания и предотвращения эпидемий кори, полиомиелита, гриппа и др. социально опасных болезней в медицинской практике проводят соответствующую иммунную профилактику людей с раннего возраста и/или в процессе их жизни [11–14]. Специфическая профилактика ряда инфекционных болезней введена в календарь медицинских прививок. Производство иммунопрофилактических препаратов подразумевает строгое соблюдение регламента изготовления в целях их соответствия заданным стандартным требованиям^¹, в том числе по безопасности и специфической эффективности, а также проведение контроля указанных параметров [15, 16]. Специфическую эффективность вакцинных препаратов стандартизируют по показателям стимуляции гуморальных факторов иммунитета, формируемых в организме привитых модельных биологических объектов.

В связи с возникновением пандемии новой коронавирусной инфекции (COVID-19) в разных странах были разработаны различные вакцины против этой болезни, из которых одни получили международное признание, другие используются в национальных масштабах [17–19]. В Республике Казахстан в период пандемии COVID-19 применяли импортные вакцины («Спутник V», Россия; SinoVac, Китай; Pfizer, США) и отечественную вакцину (QazVac, Казахстан) против этой патологии, высокая безопасность и удовлетворительная эффективность которых была продемонстрирована в клинических исследованиях [20–22]. При оценке иммунизирующей эффективности отечественной вакцины QazVac в качестве биологической модели используются сирийские хомяки, которых прививают испытуемой серией вакцины, а через 7 сут после введения второй дозы препарата подвергают исследованию на содержание специфических вируснейтрализующих антител [23]. Согласно требованиям Аналитического нормативного документа (АНД) контроля качества^² на препарат, в образцах сыворотки крови модельных животных в эти сроки должны в ходе реакции нейтрализации (РН) определяться специфические антитела в титре не ниже 32. Использование сирийских хомяков в качестве лабораторной модели для оценки иммуногенной активности вакцины было связано с тем, что эти животные восприимчивы к заболеванию COVID-19 [24, 25] и в их организме в постинфекционный период формируются специфические антитела к S-белку вируса SARS-CoV-2. От начала пандемии новой коронавирусной инфекции до настоящего времени было опубликовано большое количество исследовательских работ, в которых авторами были использованы разные виды животных в качестве биологической модели при производстве и контроле иммунобиологических препаратов против COVID-19 [25–35]. О восприимчивости к вирусу SARS-CoV-2 мелких грызунов Rodentia (мыши, сирийские хомяки) [36–39], хищных животных Carnivora (хорьки, кошки, собаки) [40–42] и нечеловекообразных обезьян Primates (зеленая мартышка, обыкновенная игрунка, африканский бабуин, макак-резус) сообщили ряд ученых, с работами которых можно ознакомиться в базах данных bioRxiv, Medline и PubMed [43–48]. Однако опыт использования сирийских хомяков показал, что часто в их организме содержатся специфические антитела к вирусу SARS-CoV-2 [49] до начала исследования и, соответственно, их наличие не позволяет получать достоверные сведения о стандартности испытуемой вакцины.

Цель исследования – определение иммунной реактивности белых мышей на прививку вакциной QazVac для установления возможности их использования в качестве биологической модели в оценке иммуногенности вакцины вместо сирийских хомяков.

Материалы и методы

Вакцина. В качестве иммунизирующего инструмента была использована вакцина QazVac, изготовленная из варианта «Омикрон-Южная Африка» вируса SARS-CoV-2 в трех сериях (серии № 1, № 2, № 3) по действующей стандартной технологии.

Вирус. Для производства испытуемой вакцины и постановки РН был использован штамм генетического варианта «Омикрон-Южная Африка» вируса SARS-CoV-2, адаптированный в культуре клеток Vero с биологической активностью 6,67 ± 0,22 lg ТЦД₅₀/см³.

Культура клеток. Для получения биомассы вируса SARS-CoV-2 и постановки РН использовали линию культуры клеток Vero (WHO), сертифицированную Всемирной организацией здравоохранения, выращенную монослоем в пластиковых клеточных фабриках Cell Factory, матрасах и планшетах. Клетки выращивали в питательной среде DMEM с содержанием 5–10% фетальной сыворотки крови крупного рогатого скота (FBS). Для поддержания жизнеспособности клеток использовали ту же питательную среду, но с содержанием 1–2% FBS.

Животные. В качестве лабораторных животных были использованы клинически здоровые золотистые сирийские хомяки живой массой 70–80 г и беспородные белые мыши, свободные от патогенной микрофлоры (СПФ), живой массой 18–22 г. Животных содержали в условиях научно-экспериментальной биологической клиники (ABSL-2) с уровнем биологической безопасности II, где предусмотрены санитарный пропускник, приточно-вытяжная вентиляция, оснащенная фильтрами тонкой очистки HEPA, специальные клетки для содержания животных с автономной подачей воздуха, корма и воды.

Оценка иммунной реактивности животных. Оценку иммунной реактивности модельных животных проводили по количеству сероконверсивности, скорости и динамике титров антител на вирус SARS-CoV-2, формируемых в организме после прививки испытуемой вакциной. В случае серопозитивности животных до прививки вакциной или плацебо уровень иммунной реактивности рассчитывали по разнице титров антител между контрольными и привитыми вакциной моделями или по разнице титров антител до и после вакцинации. Специфические антитела выявляли и устанавливали их титр с помощью РН.

Постановка реакции нейтрализации. РН проводили на монослойной культуре клеток Vero, приготовленной в 96-луночных пластиковых планшетах. В качестве реакционной смеси использовали двукратные разведения (1 : 2, 1 : 4 и т.д.) исследуемой сыворотки крови сирийских хомяков и белых мышей на поддерживающей среде и культуральную суспензию вируса SARS-CoV-2 варианта «Омикрон» с титром 100 ТЦД₅₀, взятых в равных объемных соотношениях. Полученную смесь выдерживали при температуре 37 °С в течение 60 мин и вносили в равных дозах в не менее чем 4 лунки 96-луночного планшета с тестовой культурой клеток. В качестве контроля дозы суспензию вируса титровали на той же культуре клеток используя ее десятикратные (10⁻¹, 10⁻²,10⁻³, 10⁻⁴) разведения на поддерживающей среде. Для контроля качества культуры клеток оставляли не менее 4 лунок без внесения реакционной смеси и вируса, но с заменой на поддерживающую среду. Культуру клеток в планшетах с РН выдерживали при температуре 37 °С в течение 5 сут, после чего проводили учет результатов по цитопатическому действию (ЦПД) вируса. Отсутствие ЦПД в культуре клеток, при наличии его в контрольных лунках с дозой вируса и отсутствии в лунках с контролем качества культуры клеток, определяли как нейтрализацию вируса или наличие антител, а наличие ЦПД, при указанных состояниях в перечисленных контролях, – как отсутствие нейтрализации и специфических антител. За титр антител принимали то наивысшее разведение сыворотки крови, которое в не менее 50% случаев нейтрализовало репродукцию вируса. Титр антител описывали в обратных цифровых величинах двукратных разведений сыворотки крови. Титр вируса и сыворотки крови рассчитывали по L. Reed и H. Muench [50]. Достоверность разности титров антител, формируемых у модельных животных, устанавливали по Стьюденту [51–53].

Иммунизация животных. Иммунизацию модельных животных проводили путем внутримышечного введения испытуемой вакцины в дозе 0,5 мл в четырехглавую мышцу левой задней конечности. Перед инъекцией место укола обрабатывали 70°этиловым спиртом и высушивали. Контрольным животным вместо вакцины вводили коммерческий физиологический раствор хлорида натрия (АО «ХимФарм», Шымкент).

Определение безопасности. Безопасность вакцины оценивали путем проведения процедур контроля качества согласно требованиям АНД на препарат и по результатам инъекций двух его иммунизирующих человеческих доз 10 сирийским хомякам и 10 беспородным белым мышам категории СПФ внутримышечно в мышцы задних конечностей. Вакцину считали безопасной в случае соответствия стерильности, содержания эндотоксина, общего белка, клеточной ДНК и пирогенности нормативным значениям, установленным в АНД, а также при выживании всех привитых двойной дозой препарата сирийских хомяков и белых мышей без развития местной и общей патологии в течение 14 сут.

Схема исследования иммуногенности. Сирийских хомяков и белых мышей разделили на 5 групп по 20 голов каждого вида: 1-ю группу животных прививали вакциной серии № 1, 2-ю – вакциной серии № 2, 3-ю – вакциной серии № 3, 4-ю – плацебо, а 5-ю группу оставляли без экспериментального вмешательства. За привитыми и контрольными животными вели ежедневное клиническое наблюдение с регистрацией температуры тела, живой массы. Перед постановкой эксперимента от всех сирийских хомяков и белых мышей собирали образцы сыворотки крови. При этом образцы крови от сирийских хомяков собирали из межрезцовой вены, а у мышей – из подхвостовой вены. На 14, 21, 28, 35-е сутки после инъекции вакцины и плацебо сыворотку крови собирали от 5 голов животных каждого вида, у сирийских хомяков из межрезцовой вены, а у мышей – из шейных сосудов тотально путем декапитации. Образцы сыворотки крови перед исследованием в РН подвергали термической обработке при температуре 56 °С в течение 30 мин.

Статистическая обработка. Статистический анализ результатов проводили с использованием программного обеспечения GraphPad Prism8. Достоверность различий между показателями (р ≤ 0,05) определяли с применением критерия Стьюдента.

Авторы подтверждают соблюдение институциональных и национальных стандартов по использованию лабораторных животных в соответствии с Consensus author guidelines for animal use (IAVES 23 July 2010). Протокол исследования одобрен Комитетом по биоэтике Научно-исследовательского института проблем биологической безопасности Министерства здравоохранения Республики Казахстан (Протокол № 2 от 14.08.2023).

Результаты

Контроль используемых серий вакцины показал, что они содержат количество водородных ионов в пределах 7,24–7,31, общего белка – 92,765–99,343 мкг/0,5, клеточной ДНК – 37,32–38,94 нг/0,5, эндотоксинов не более 0,15 МЕ/мл и формальдегида не более 20 мг/л. Результаты испытания на стерильность с помощью высева на питательные среды (мясопептонный бульон, мясопептонный агар, Сабуро и тиогликолевую) были отрицательными, что указывало на чистоту от посторонних микроорганизмов.

Сирийские хомяки и белые мыши, получившие 2 дозы вакцины внутримышечно, остались живыми и здоровыми в течение 14 сут наблюдения, кроме первого дня после инъекции препаратом, когда отмечали пониженную подвижность животных в течение 2–4 ч. В остальное время животные обоих видов, привитые двумя дозами вакцины, были активными и здоровыми. В месте введения вакцины в течение наблюдаемого периода какие-либо патологии не развивались.

Исходя из полученных результатов исследований было сделано заключение о том, что три серии вакцины, подвергшиеся исследованию, являются безопасными и пригодными для оценки иммуногенности на модельных животных, а при необходимости и на людях-добровольцах.

Все животные, привитые вакциной и плацебо, а также содержавшиеся в чистом контроле в течение всего периода наблюдения, который длился 35 сут, оставались живыми и здоровыми. Результаты исследований образцов сыворотки крови, собранных до постановки опыта и в последующие сроки после введения вакцины и плацебо, в РН показаны в табл. 1.

Таблица 1. Динамика титров ВНА в сыворотке крови сирийских хомяков до и после прививки вакциной QazVac

Table 1. Dynamics of virus-neutralizing antibody titers in blood serum of Syrian hamsters before and after vaccination with QazVac vaccine

Группа

Group №

Серия вакцины

Vaccine series

Число животных, абс.

Number of animals, abs.

Сроки исследования сыворотки крови, сут

Time of serum examination, days

QazVac,

серия 1

series 1

3,6 ± 1,4

(10)

19,2 ± 6,4

(5)

96,4 ± 31,35

(5)

132,5 ± 62,71

(5)

114,0 ± 27,3

(5)

QazVac,

серия 2

series 2

(10)

10,0 ± 3,2

(5)

78,2 ± 25,60

(5)

102,6 ± 31,35

(5)

79,6 ± 25,97

(5)

QazVac,

серия 3

series 3

8,8 ± 2,8

(10)

26,8 ± 7,84

(5)

84,2 ± 29,73

(5)

110,4 ± 25,60

(5)

105,2 ± 31,4

(5)

Средние данные по трем группам

Average data for the three groups

3,9 ± 1,9

(30)

18,7 ± 6,12

(15)

86,2 ± 28,89

(15)

115,2 ± 39,87

(15)

99,6 ± 28,22

(15)

Плацебо – физ.

раствор

Placebo – physical solution

3,06 ± 1,7

(10)

3,86 ± 1,4

(10)

3,8 ± 1,4

(10)

2,8 ± 0,76 (10)

2,5 ± 0,82

(10)

Кратность повышения титров антител в опытных группах от уровня титров антител в контрольной группе

Multiplicity of the increase in antibody titers in the experimental groups compared to the level of antibody titers in the control group

1,27

4,84

22,68

41,14

39,84

Примечание. Здесь и в табл. 2: ВНА – вируснейтрализующие антитела; титры антител в обратных величинах кратности разведения сыворотки крови; в скобках – число животных.

Note. Here and in the table. 2: VNA – virus-neutralizing antibodies; antibody titers in inverse multiples of serum dilution; number of animals in parentheses.

Как видно из данных табл. 1, в образцах сыворотки крови большинства сирийских хомяков до начала исследования присутствовали факторы, нейтрализующие вирус SARS-CoV-2. Серопозитивные животные были выявлены в двух группах, использованных для прививки вакциной, и группе плацебо. Средние титры таких факторов составляли 3,06 ± 1,7 в группе плацебо и 3,6 ± 1,4 и 8,8 ± 2,8 в 1-й и 3-й группе соответственно. Животные 2-й группы были полностью интактны от антител, нейтрализующих вирус SARS-CoV-2.

В образцах сыворотки крови всех животных, привитых вакциной, не зависимо от серии препарата, к 14-м суткам в группах отмечался рост титров антител, нейтрализующих вирус SARS-CoV-2, от 10,0 ± 3,2 до 26,8 ± 7,84, которые превышали исходные титры в 5,3 раза в 1-й группе, 10-кратно во 2-й группе и 3-кратно в 3-й группе. Среднее значение титров антител по трем группам составило 18,7 ± 6,12, что означает прирост в 4,8 раза от исходного среднего титра 3,9. В группе плацебо кратность прироста антител в этот срок была незначительной и составила 1,7.

В последующие сроки в сыворотке крови животных, привитых вакциной, был зарегистрирован дальнейший рост титров антител. К 21-м суткам в группах было зафиксировано нарастание титра от 78,2 ± 25,60 до 96,4 ± 31,35 со средним значением для всех трех групп 86,2 ± 28,89. К 28-м суткам титры антител в группах животных с вакцинацией достигли максимальных значений, колебавшихся от 102,6 ± 31,35 до 132,5 ± 62,71, со средним показателем 115,2 ± 39,87. Средние значения кратности прироста титров антител по сравнению с исходными составили к 21-м суткам 22,1 и к 28-м суткам 29,5, а по отношению к титрам контрольной группы – 22,6 и 41,1 соответственно. На 35-е сутки этот показатель оставался высоким и составил 39,84. В то время как у контрольных животных за весь период наблюдения прирост антител, нейтрализующих вирус SARS-CoV-2, не отмечался.

Анализ индивидуальной серопозитивности по антителам на вирус SARS-CoV-2 показал, что у сирийских хомяков, привитых вакциной, уровень сероконверсии составил 100%, т.е. у всех привитых животных формировались вируснейтрализующие антитела, титры которых возрастали с течением времени.

В исследованиях, проведенных аналогичным образом параллельно на белых мышах, были получены также положительные результаты, которые приведены в табл. 2.

Таблица 2. Динамика титров ВНА в сыворотке крови белых мышей категории СПФ после прививки вакциной QazVac

Table 2. Dynamics of virus-neutralizing antibody titers in serum of SPF white mice after inoculation with QazVac vaccine

Группа

Group №

Серия вакцины

Vaccine series

Число животных, абс.

Number of animals, abs.

Сроки исследования сыворотки крови, сут

Time of serum examination, days

QazVac,

серия 1

series 1

(20)

4,4 ± 0,96

(5)

89,2 ± 31,4

(5)

104,6 ± 31,4

(5)

98,4 ± 29,4

(5)

QazVac,

серия 2

series 2

(20)

8,1 ± 1,71

(5)

112,4 ± 25,7

(5)

129,3 ± 37,11

(5)

119,4 ± 27,8

(5)

QazVac,

серия 3

series 3

(20)

5,6 ± 1,19

(5)

97,4 ± 32,9

(5)

106,4 ± 27,6

(5)

113,6 ± 33,6

Средние данные по трем группам

Average data for the three groups

(60)

6,03 ± 1,54

(15)

99,67 ± 29,6

(15)

113,43 ± 32,03

(15)

110,46 ± 38,8

(15)

Плацебо – физ. раствор

Placebo – physical solution

(20)

1,4 ± 0,8

(5)

4,8 ± 1,6

(5)

8,8 ± 3,91

(5)

3,6 ± 0,8

(5)

Кратность повышения титров антител в опытных группах от уровня титров антител в контрольной группе

Multiplicity of the increase in antibody titers in the experimental groups compared to the level of antibody titers in the control group

4,31

20,76

12,89

30,68

Как видно из данных табл. 2, в образцах сыворотки крови белых мышей, в отличие от сирийских хомяков, до вакцинации не выявлялись факторы, нейтрализующие вирус SARS-CoV-2. Одно у интактных животных контрольной группы такие факторы были обнаружены в низких титрах после введения плацебо. В группах белых мышей опытных групп, подвергнутых вакцинации, с 14-х суток определялись антитела в невысоких титрах, которые уже в этот срок более чем 4-кратно превышали вируснейтрализующий уровень факторов контрольной группы. В последующие сутки титры антител у привитых вакциной белых мышей увеличились значительно и достигли максимальных значений на 21, 28, 35-е сутки, средние значения титров составляли 99,67 ± 29,61, 113,43 ± 32,03 и 110,46 ± 38,85 соответственно. Серопозитивность среди привитых белых мышей во всех группах составила, как и у сирийских хомяков, 100%. Максимальные титры антител были зарегистрированы на 28-е сутки, их среднее значение составило 113,43 ± 32,03. На 21-е сутки после первой вакцинации титры антител у вакцинированных животных более чем 20-кратно превышали неспецифический фон задержки репродукции вируса, отмечаемый в контрольной группе, а на 28-е сутки этот показатель был равен 12,9. При этом уровень кратности превышения титров антител в опытной группе по сравнению с контрольной к 35-м суткам был предельно высоким и составил 30,7.

Результаты исследований, полученные при проведении РН, показали, что как у сирийских хомяков, так и белых мышей после иммунизации вакциной QazVac выявляется поствакцинальная серопозитивность в 100% случаев. Вируснейтрализующие антитела в сыворотке крови сирийских хомяков и белых мышей определялись с 14-х суток после вакцинации в титрах 18,7 ± 6,12 у сирийских хомяков и 6,03 ± 1,54 у белых мышей, которые достигали максимальных значений в течение последующих 7–21 сут. У сирийских хомяков максимальные титры антител в этот период колебались в пределах от 86,2 ± 28,89 до 115,2 ± 39,87, а у белых мышей – от 99,67 ± 29,6 до 113,43 ± 32,03. Приведенные данные указывают на то, что беспородные белые мыши обладают достаточной иммунной реактивностью в отношении цельновирионного антигена вируса SARS-CoV-2, находящегося в составе инактивированной вакцины [57, 58]. Однако необходимо подчеркнуть, что иммунная реактивность сирийских хомяков несколько превышала показатели белых мышей, т.к. у первых кратность увеличения титра антител на всех сроках исследования имела большее числовое значение. Однако эта разница до 21-х суток не имела значимого различия. Различие в кратности прироста титра антител отмечалось, начиная с 28-х по 35-е сутки после иммунизации.

Преимуществом беспородных белых мышей категории СПФ является то, что они до использования в исследованиях гарантированно свободны от вируса SARS-CoV-2 и антител к этому возбудителю. Такое состояние позволяет получать стандартные результаты оценки иммуногенности испытуемого препарата^[3], ⁴[59].

Обсуждение

Оценка иммуногенной активности вакцины QazVac (QazCOVID-in) проводится по уровню антител, формируемых в организме сирийских хомяков после двукратного введения этого препарата [23]. Этот вид животных был взят в качестве лабораторной модели для стандартизации иммуногенной активности вакцины вследствие его сравнительно высокой восприимчивости к COVID-19 и достаточной иммунной реактивности на возбудитель этой болезни [24–26]. Однако в процессе использования этих животных было отмечено, что в организме ряда из них выявляются гуморальные факторы, нейтрализующие вирус SARS-CoV-2 в титрах, достигающих до 5–6 log₂(неопубликованные данные). Вероятно, эти факторы являются следствием контакта животных с пандемическим вирусом через корма и/или с обслуживающим персоналом в процессе размножения и выращивания, т.к. животные поставляются частными предпринимателями, которые содержат их в условиях, не обеспечивающих биологическую безопасность от патогенных микроорганизмов, в том числе от коронавирусной инфекции COVID-19. Отсутствие интактности лабораторной модели не дает возможности утвердительно оценивать иммуногенную активность испытуемого препарата, в связи с чем приходится дополнительно подбирать животных, свободных от целевых антител. В таком случае процесс стандартизации вакцины может выйти за пределы регламентного срока. Кроме того, статистический анализ влияния нейтрализующих факторов в организме сирийских хомяков, имевшихся до вакцинации, на последующую иммунную реактивность животного или выработку антител показывает, что имеется корреляция (статистическая значимость разницы) между наличием нейтрализующего фактора SARS-CoV-2 и выработкой антител [54]. Эта статистически достоверная разница выявлялась на уровне значимости p = 0,05 с доверительным интервалом 0,95 [55]. Вышеперечисленное не позволяет стандартизовать иммуногенность препарата по кратности увеличения титра антител с использованием серопозитивных животных.

В этой связи с целью замены сирийских хомяков в испытаниях были использованы беспородные белые мыши, выращенные в условиях, свободных от патогенной микрофлоры. Исследования были проведены с использованием трех серий вакцины параллельно на указанных двух модельных видах животных.

Результаты исследований показали, что белые мыши так же, как и сирийские хомяки, оказались иммунореактивными на инактивированный антиген вируса SARS-CoV-2 при внутримышечном введении в виде вакцины QazVac, сорбированной на гидрате окиси алюминия. У животных обоих видов, привитых вакциной, с 14-х суток сформировалась серопозитивность 100%. Динамика титров антител у белых мышей близко напоминала таковую у сирийских хомяков. Средние числовые значения титров антител у сирийских хомяков на 14-е сутки в 3,1 раза превышали уровень средних титров антител, выявляемых у белых мышей. Однако кратность увеличения титров антител по сравнению с данными контрольной группы у испытуемых видов животных была одинаковой и равнялась 4,31 у белых мышей и 4,84 у сирийских хомяков. Титры антител в последующие 3 нед (21–35-е сутки) у обоих видов животных имели одинаковую динамику роста до максимальных значений к 28-м суткам и с незначительным снижением к 35-м суткам. Уровень титров антител у сирийских хомяков в эти сроки составлял от 86,2 ± 28,89 до 115,2 ± 39,87, а у белых мышей – от 99,67 ± 29,6 до 113,43 ± 32,03 и не имел значимых различий. Кратность увеличения титров антител по сравнению с иммунным фоном контрольной группы животных была примерно одинаковой у обоих видов на 21-е сутки. В последующие сроки этот показатель у сирийских хомяков (41,14 и 39,84 на 28-е и 35-е сутки соответственно) значительно превышал таковой, установленный для белых мышей (12,89 и 30,68 на 28-е и 35-е сутки соответственно), что свидетельствовало о сравнительно большей их иммунной реактивности.

Анализ результатов сравнительных испытаний показывает, что белые мыши так же, как и сирийские хомяки, обладают достаточной иммунной реактивностью на прививку инактивированной вакциной QazCOVID-in (QazVac) и в их организме формируются специфические антитела на вирус SARS-CoV-2. Выявленная иммунная реактивность белых мышей, несмотря на сравнительно меньшую выраженность, чем у сирийских хомяков, вполне достаточна для оценки иммуногенной активности испытуемой вакцины. Белые мыши категории СПФ превосходят сирийских хомяков по интактности от антител на вирус SARS-CoV-2. Исходя из приведенных характеристик, беспородные белые мыши категории СПФ могут быть использованы при оценке иммуногенности вакцины QazVac в качестве новой биологической модели. Согласно данным динамики накопления и титров антител, контрольной точкой оценки иммуногенной эффективности вакцины можно обозначить 21-е сутки после первого введения вместо 7 сут после ревакцинации, проводимой с интервалом в 21 сут, т.е. на 35-е сутки после первого введения вакцины. В таком случае срок стандартизации иммуногенности препарата сократится на 14 сут.

Заключение

Проведена оценка иммунной реактивности сирийских хомяков и беспородных белых мышей категории СПФ на иммунизирующий антиген инактивированного вируса SARS-CoV-2 с использованием трех серий вакцины QazVac против коронавирусной инфекции COVID-19 по динамике вируснейтрализующих антител.
Согласно результатам исследований, беспородные белые мыши категории СПФ обладают достаточной иммунной реактивностью на введение вакцины QazVac и в их организме формируются специфические антитела на вирус SARS-CoV-2, так же как и у сирийских хомяков, в 100% случаев с 14-х суток после иммунизации. При этом титры вируснейтрализующих антител достигают максимальных значений у обоих видов животных в период с 21-х по 35-е сутки и варьируют у сирийских хомяков в пределах от 86,2 ± 28,89 до 115,2 ± 39,87, у белых мышей от 99,67 ± 29,60 до 113,43 ± 32,03 и между собой не имеют значимых различий.
Согласно результатам сравнительной оценки кратности увеличения титров специфических антител, иммунная реактивность сирийских хомяков и белых мышей в первые 21 сут представляется равнозначной, а в последующие сроки (28–35-е сутки) у сирийских хомяков она значительно превышает таковые показатели у белых мышей.
Согласно результатам исследований, у интактных сирийских хомяков часто выявляются факторы гуморального иммунитета, нейтрализующие вирус SARS-CoV-2, в то время как белые мыши категории СПФ являются свободными от антител на возбудителя коронавирусной инфекции COVID-19. Предварительная специфическая серопозитивность у сирийских хомяков оказывает значимое влияние на уровень формирования поствакцинальных антител, вследствие чего достоверность результатов, получаемых при контроле, становится сомнительной.
Полученные данные свидетельствует о том, что иммунная реактивность белых мышей на введение вакцины QazVac по скорости и динамике формирования вируснейтрализующих антител является примерно равнозначной иммунной реактивности сирийских хомяков. В организме белых мышей категории СПФ до введения вакцины, в противовес сирийским хомякам, не содержится факторов гуморального иммунитета, специфичных на вирус SARS-CoV-2. Равнозначная иммунная реактивность с иммунной реактивностью сирийских хомяков и чистота от антител на вирус SARS-CoV-2 показывают превосходство использования белых мышей при оценке иммунизирующей активности вакцин против коронавирусной инфекции COVID-19. Результаты исследований позволяют проводить стандартизацию иммуногенности вакцины на 21-е сутки после первого введения вакцины вместо действующих 35 сут по АНД.
Имеется корреляция (статистическая значимость разницы) между наличием нейтрализующего фактора SARS-CoV-2 и выработкой антител [53, 54]. Эта статистически достоверная разница выявлялась на уровне значимости p = 0,05 с доверительным интервалом 0,95 [55]. Степени свободы для t-критерия Стьюдента с двумя независимыми выборками ‒ k = 8 [56]. Применение t-критерия обусловлено малой мощностью выборок (n < 30, m < 30). Отличие от Z-критерия несущественное с учетом поправки выборочных средних, таких как дисперсия или среднеквадратическое отклонение. Используя распределение параметров для элементов выборки в заданных диапазонах, заключаем, что разница статистически достоверна с уровнем доверия ‒ p = 0,95.

Благодарности. Авторы выражают благодарность руководству и сотрудникам института за оказанную помощь в проведении данных исследований.

Источник финансирования. Работа выполнена в рамках Государственного задания «Услуги по обеспечению биологической безопасности в сфере науки» на 2023 год, при финансовой поддержке Министерства здравоохранения Республики Казахстан.

Конфликт интересов. Авторы декларируют отсутствие явных и потенциальных конфликтов интересов, связанных с публикацией настоящей статьи.

Этическое утверждение. Авторы подтверждают соблюдение институциональных и национальных стандартов по использованию лабораторных животных в соответствии с Consensus author guidelines for animal use (IAVES 23 July 2010). Протокол исследования одобрен Комитетом по биоэтике Научно-исследовательского института проблем биологической безопасности Министерства здравоохранения Республики Казахстан (Протокол № 2 от 14.08.2023).

Acknowledgment. The authors express their gratitude to the management and staff of the institute for their assistance in conducting these studies.

Funding. The work was carried out within the framework of the State assignment «Services for ensuring biological safety in the field of science» for 2023, with financial support from the Ministry of Health of the Republic of Kazakhstan.

Conflict of interest. The authors declare no apparent or potential conflicts of interest related to the publication of this article.

Ethics approval. The authors confirm compliance with institutional and national standards for the use of laboratory animals in accordance with Consensus author guidelines for animal use (IAVES 23 July 2010). The research protocol was approved by the Bioethics Committee of the Research Institute for Biological Safety Problems of the Ministry of Health of the Republic of Kazakhstan (Protocol No 2 dated August 14, 2023).

¹ WHO. Coronavirus (COVID-19) Dashboard. Available at: https://covid19.who.int

² Аналитический нормативный документ (АНД) контроля качества инактивированной вакцины QazCOVID-in (QazVac). Гвардейский; 2021.

³ Решение Комитета по Биоэтике Научно-исследовательского института проблем биологической безопасности Министерства здравоохранения Республики Казахстан. Протокол № 2; 2023.

⁴ ГОСТ 33215–2014. Руководство по содержанию и уходу за лабораторными животными. Правила оборудования помещений и организации процедур. Межгосударственный стандарт; 2014.