Частота встречаемости мутаций лекарственной устойчивости и ускользания от иммунного ответа в геноме вируса гепатита В, выявленного у беременных в Гвинейской Республике

Полный текст

Введение

Вирус гепатита В (ВГВ) является одним из наиболее распространённых гепатотропных вирусов и может вызывать как острое, так и хроническое заболевание печени. В настоящее время более чем 360 млн человек поставлен диагноз «хронический вирусный гепатит В» (ХГВ) [1]. При этом ежегодно регистрируется 1,5 млн новых случаев инфицирования и 887 тыс. случаев смерти от этой хронической инфекции [2]. Основным лабораторным диагностическим маркером заболевания является поверхностный антиген ВГВ (HBsAg), встречаемость которого в популяции зависит от географического региона [3].

Одним из регионов с крайне высокой распространённостью ХГВ является Африка: здесь встречаемость HBsAg превышает 8% и может достигать 25%, а суммарное количество больных составляет приблизительно 75 млн человек, 25% из которых, согласно расчётам, умрут от заболеваний печени [4]. В странах Африки к югу от Сахары, в том числе в её западной части, основными путями передачи являются вертикальный – от матери к ребёнку во время родов и горизонтальный – в раннем детстве при тесном бытовом контакте с инфицированными родителями, сиблингами или иными родственниками [2].

Перинатальное и раннее детское инфицирование ВГВ не только приводит к повышенному риску хронизации заболевания, но и является сильным предиктором неблагоприятных долгосрочных исходов цирроза печени и гепатоцеллюлярной карциномы [5]. Критическое значение имеет скрининг на ВГВ всех беременных женщин. Около 75 млн женщин детородного возраста во всём мире больны ХГВ, что составляет около 25,3%. При отсутствии мер профилактики ВГВ частота передачи вируса от матери к ребёнку составляет 31,3% [6]. Сосредоточение внимания на инфицированных женщинах и предоставление профилактического лечения женщинам с высокой вирусной нагрузкой может быть эффективным подходом к снижению передачи инфекции ребёнку [7]. Учитывая цель Всемирной организации здравоохранения (ВОЗ) по ликвидации к 2030 г. вирусного гепатита как серьёзной угрозы общественному здравоохранению, сокращение передачи вируса от матери ребёнку посредством всеобщей вакцинации младенцев и введения иммуноглобулина против ВГВ новорождённым от инфицированных женщин, является приоритетным для профилактики гепатита В (ГВ) [8]. Современные методы терапии редко позволяют излечить ХГВ из-за рефрактерной природы внутриклеточной вирусной репликации кольцевой ковалентно замкнутой ДНК ВГВ, которая находится в ядре инфицированных клеток в виде эписомальной плазмиды и даёт возможность постоянного обновления вирусного пула в организме [9]. Однако уменьшение вирусной нагрузки при лечении беременных женщин значительно снижают риск пренатального инфицирования ребёнка [10]. Несмотря на все усилия по ограничению передачи ВГВ от матери ребёнку, понимание течения ХГВ у беременных женщин всё ещё ограниченно. Кроме того, серьёзным фактором, способным повлиять как на лечение, так и на вакцинную профилактику, могут являться мутации вируса. Таким образом, изучение генетической гетерогенности ВГВ является значимой задачей научных исследований.

ВГВ характеризуется высокой степенью генетической гетерогенности и в настоящее время подразделяется на десять генотипов (А–I), которые отличаются друг от друга по составу нуклеотидных последовательностей более чем на 8%. Кроме того, генотипы A, B, C, D, F и H подразделяют на субгенотипы, демонстрирующие дивергенцию нуклеотидных последовательностей в диапазоне от 4 до 7,5% [11]. В большинстве географических регионов за редким исключением преобладают 1–2 основных генотипа и несколько второстепенных, в том числе завезённых из других регионов [12]. Генотипы A, D и E являются наиболее распространёнными, обнаруженными в Африке. При этом ВГВ типа А широко распространён во всем мире и преобладает в странах Южной, Центральной и Восточной Африки, в то время как генотип Е доминирует в Западной и Центральной части континента. Однако распространённость этих генотипов может значительно различаться даже в пределах одной страны. Высокая степень генетической изменчивости ВГВ позволяет ему реагировать на эндогенное и экзогенное селективное давление путём дальнейшей модуляции структуры своего генома. Во время длительной инфекции и при различных селективных воздействиях некоторые варианты, особенно в гене S, могут эволюционировать и тем самым помочь вирусу избежать терапевтических, профилактических и диагностических мер [13].

Ген оболочки ВГВ имеет три открытые рамки считывания (open reading frames) – PreS1, PreS2 и S, которые кодируют три белка – малый, средний и большой HBsAg, транслируемые с разных матричных РНК. Большой ген S ВГВ кодирует белок preS1 (108 а.о.), белок preS2 (55 а.о.) и малый S-белок HBsAg (226 а.о.). Как до, так и после противовирусной терапии мутации в S-области (область малого поверхностного антигена ГВ) в основном происходят в N-концевом регионе (1–99 а.о.) и в большом гидрофильном регионе (major hydrophilic region – MHR) (100–169 а.о.), а не в С-концевой области (170–226 а.о.). При этом MHR, для которого показано относительно большое количество аминокислотных замен, включает детерминанту α (124–147 а.о.), третичная структура которой определяет антигенную специфичность. Таким образом, эффективность вакцинации и терапии может быть снижена из-за появления клинически значимых мутаций: мутаций ускользания от иммунного ответа (escape mutations – EM), мутаций лекарственной устойчивости (ЛУ) и мутаций, влияющих на прогрессирование заболевания [14]. Причём из-за перекрывания генов S и обратной транскриптазы (RT) ЛУ в гене RT могут приводить к возникновению EM в MHR, и наоборот [15].

Гвинейская Республика, расположенная в Западной Африке, является регионом с высокой распространённостью многих вирусных инфекционных заболеваний, в том числе вызываемых гепатотропными вирусами, что подчёркивает важность эпидемиологической оценки данной территории для определения ситуации по ВГВ [16]. При этом в Гвинее вакцинация против ГВ с 2006 г. включена в национальный календарь иммунизации, но не проводится при рождении. Рекомендованный график включает двукратное введение вакцины в возрасте 2 и 4 месяцев с последующей ревакцинацией в 11 месяцев. В возрасте 11–15 лет ранее невакцинированным подросткам показана вакцинация либо по схеме трёх доз, либо в соответствии с режимом введения двух доз с интервалом не менее 6 месяцев. Тем не менее, согласно отчетам Министерства здравоохранения Гвинеи, охват вакцинацией в стране не превышает 47% населения [17].

В 2021 г. в Гвинее были разработаны новые программные стандарты и процедуры расширенной вакцинации, согласно целям которой в будущем планируется внедрение вакцинации против ГВ при рождении, однако в представленном календаре описано несколько схем вакцинаций – как при рождении, так и, например, трёхкратное введение в 6, 10 и 14 недель. Следует также отметить, что поставки медицинских препаратов, включая вакцины, в Гвинейской Республике крайне ограничены не только из-за высокой для страны стоимости препаратов, но и из-за отсутствия налаженной системы хранения и транспортировки веществ, требующих соблюдения холодовой цепи. Ещё одной проблемой является недоверие населения к врачам, проявляющееся в том числе отказом матерей от вакцинации детей. Обязательного скрининга населения, включая беременных женщин, на HBsAg в Гвинее не проводится. Исследования ГВ ограничены как по количеству, так и по качеству используемых методов диагностики. Так, крайне невелико количество публикаций, посвящённых молекулярно-генетическим особенностям вируса в стране [18]. Ранее мы сообщали о случаях выявления у беременных женщин в Конакри escape-мутаций, способных приводить к ускользанию вируса от диагностики при скринировании на HBsAg [19]. Однако подробного анализа именно у беременных женщин в Гвинее не проводили.

Цель нашей работы – оценить распространённость мутаций ЛУ и ускользания от иммунного ответа ВГВ у беременных женщин в Гвинейской Республике.

Материалы и методы

В работе использованы образцы плазмы крови, полученные от 1810 беременных женщин из разных регионов Гвинейской Республики. Возраст обследованных варьировал от 13 до 55 лет и составил в среднем 25,8 года. При этом 402 женщины (22,21%) проживают в сельской местности, а 1408 (77,79%) – в городской. Ни одной из женщин ранее не был поставлен диагноз «вирусный ГВ», для всех обследованных скринирование на маркеры ГВ впервые осуществлялось в рамках настоящего исследования.

Лабораторные исследования проводили на базе Российско-гвинейского научного исследовательского центра эпидемиологии и профилактики инфекционных болезней, расположенного на территории Института прикладной биологии Гвинеи (IRBAG) в префектуре Киндия. На проведение данного этапа работы было получено согласие этического комитета Гвинеи (протокол № 129/CNERS/16 от 31 августа 2015 г.). Все обследованные дали письменное информированное согласие на участие в эксперименте.

Методом иммуноферментного анализа определяли серологические маркеры ГВ (HBsAg, антител анти-HBs IgG, анти-HBcore IgG) с использованием ряда диагностических наборов производства НПО «Диагностические системы» и АО «Вектор-Бест», как было описано ранее [19]. Чувствительность тест-систем, предназначенных для выявления HBsAg, применённых в настоящем исследовании, составила 0,01 МЕ/мл.

Выявление ДНК ВГВ проводили методом полимеразной цепной реакции (ПЦР) с гибридизационно-флуоресцентной детекцией в режиме реального времени с использованием разработанной в ФБУН «Санкт-Петербургский НИИ эпидемиологии и микробиологии имени Пастера» методики, позволяющей выявлять ДНК ВГВ в биологическом материале при низкой вирусной нагрузке, в том числе при HBsAg-негативном ГВ, чувствительность метода составляет 10 МЕ/мл при экстракции из 100 мкл плазмы [16]. Нуклеотидные последовательности для определения генотипов и выявления мутаций получали путём использования nested-ПЦР с последующим секвенированием по Сэнгеру на базе перекрывающихся пар праймеров, совместно фланкирующих полный геном вируса, как было показано ранее [20]. Серотипы выявленных изолятов, характеризующие их антигенную специфичность, определяли на основании анализа нуклеотидной последовательности консервативной области детерминанты α HBsAg.

Статистическая обработка данных производилась с помощью пакета программ Microsoft Excel, Prizm 5.0. При оценке статистической погрешности использовали точный интервал Клоппера–Пирсона. Результаты представлены с указанием 95% доверительного интервала (ДИ). Для оценки достоверности различий численных данных, полученных при парных сравнениях, использовали, в зависимости от характеристик выборок, точный критерий Фишера или критерий χ² с поправкой Йейтса. В качестве порога достоверности отличий было определено значение вероятности p < 0,05.

Результаты и обсуждение

Суммарная встречаемость серологических маркеров ГВ в общей группе составила 56,63% (95% ДИ 54,31–58,93%). Результат анализа распространённости исследованных маркеров ГВ в группе представлен в табл. 1.

 

Таблица 1. Распространённость серологических маркеров ГВ (HBsAg, анти-HBcore IgG, анти-HBs IgG) в обследованной группе (n = 1810)

Table 1. Prevalence of HBV serological markers (HBsAg, anti-HBcore IgG, anti-HBs IgG) in the examined group (n = 1810)

Выявленные серологические маркеры Detected serological markers	Беременные женщины, n (%) Pregnant women, n (%)	95% доверительный интервал, % 95% Confidence Intervals, %
HBsAg+	292 (16,13)	14,47–17,91
HBs IgG+	672 (37,13)	34,90–39,40
HBcore IgG+	885 (48,90)	46,57–51,23
Серонегативные / Seronegative	785 (43,37)	41,07–45,69

 

Следует отметить, что, хотя у 37,13% беременных выявляли антитела анти-HBs IgG, только одна женщина сообщила о получении вакцинации против ГВ, во всех остальных случаях, по всей видимости, антитела имеют естественное происхождение за счёт контакта с вирусом.

При оценке распространённости молекулярно-биологического маркера ГВ ДНК вируса выявили у 480 женщин, что составило 26,52% случаев (95% ДИ 24,5–28,62%).

Распространённость ДНК ВГВ в городской и сельской местности составила 26,92% (95% ДИ 24,62–29,32%) и 25,12% (95% ДИ 20,96–29,66%) соответственно. Таким образом, достоверных различий не выявлено.

Хотя число подростковых беременностей в мире постепенно снижается, количество фактических случаев среди девушек-подростков в странах Африки не сокращается. Несмотря на определённый законодательством Гвинейской Республики возраст совершеннолетия (18 лет), всё ещё велико влияние местных культурных традиций, согласно которым девочку считают готовой для бракосочетания и деторождения с возраста появления менархе. Распределение по возрастам беременных в обследованной группе представлено на рис. 1.

 

Рис. 1. Распределение по возрастам беременных женщин в обследуемой группе.

 

С учётом того, что ВОЗ рассматривает беременность в возрасте до 19 лет включительно как подростковую, приводящую к повышенному риску системных инфекций и развития таких гинекологических заболеваний, как послеродовой эндометрит и эклампсия, для выявления закономерности встречаемости ДНК ВГВ относительно возрастного варьирования было проведено ранжирование группы по возрастам и отдельно рассмотрены группы от 13 до 17 лет (142 человека, 7,85% от общей группы), от 13 до 19 лет (382 человека, 21,1% от общей группы), от 18 до 35 лет (1496 человек, 82,65% от общей группы) и старше 35 лет (172 человека, 9,5% от общей группы). Результаты представлены в табл. 2.

 

Таблица 2. Распространённость ДНК ВГВ в разных возрастных группах

Table 2. Prevalence of HBV DNA in different age groups

Возрастные группы Age groups	Беременные женщины, n (%) Pregnant women, n (%)	95% доверительный интервал, % 95% Confidence Intervals, %
13–17 лет / years	45 (31,69)	24,14–40,02
13–19 лет / years	126 (32,98)	28,29–37,95
18–35 лет / years	381 (25,47)	23,28–27,76
>35 лет / years	54 (31,4)	24,55–38,9

 

Показаны достоверные различия в распространённости ДНК ВГВ между возрастными группами 13–19 и 18–35 лет: χ² = 8,346 при p = 0,0039, df = 1, RR = 1,295 при 95% ДИ 1,096–1,531%. Однако разницы между группами 13–17 и 18–35 лет не обнаружено: p = 0,1297.

На основании филогенетического анализа 480 изолятов показано, что в обследованной группе наиболее часто обнаруживали вирус генотипа Е (92,92%; 95% ДИ 90,24–95,05%), в значительно меньшей степени представлены генотипы А (3,13%; 95% ДИ 1,76–5,1%) и D (3,96%; 95% ДИ 2,4–6,11%). При более глубоком типировании преобладал ВГВ генотипа E (92,92%; 95% ДИ 90,24–95,05%) по сравнению с субгенотипами А1 (1,67%; 95% ДИ 0,72–3,26%), А3 (1,46%; 95% ДИ 0,59–2,98%), D1 (0,63%; 95% ДИ 0, 13–1,82%), D2 (1,04%; 95% ДИ 0, 34–2,41%) и D3 (2,29%; 95% ДИ 1,15–4,06%) (рис. 2).

 

Рис. 2. Распределение субгенотипов вируса гепатита В в обследованной группе.

 

При определении серологического подтипа обнаруженных изолятов чаще всего удалось выявить серотип ayw4 (92,92%; 95% ДИ 90,24–95,05%), к которому принадлежали все изоляты генотипа Е. Соответственно, в значительно меньшей степени представлены серотипы ayw2 (2,5%; 95% ДИ 1,3–4,33%), ayw3 (1,25%; 95% ДИ 0,46–2,7%), ayw1 (1,46%; 95% ДИ 0,59–2,98%), adw2 (1,67%; 95% ДИ 0,72–3,26%) и adw3 (0,21%; 95% ДИ 0,01–1,16%) (рис. 3). При этом для генотипа А определены два серотипа – ayw1 и adw2, в то время как для генотипа D показаны три – ayw2, ayw3 и adw3.

 

Рис. 3. Распределение серотипов вируса гепатита В в обследованной группе.

 

Распределение генотипов ВГВ в группе сопоставимо с данными о циркулирующих в регионе вариантах вируса. Так, ранее мы сообщали о преобладании в Гвинейской Республике ВГВ генотипа Е среди доноров крови (85,53%) [21]. В странах-соседях также показано доминирование генотипа Е. Например, в Мали встречаемость указанного генотипа составляет 91,1%, в Кот-д’Ивуаре – 87,4%, а в Сенегале и Буркина-Фасо – 75 и 72% соответственно [22]. Хотя ВГВ генотипа Е широко распространён в странах Африки к югу от Сахары, этот вариант возбудителя характеризуется низкой вариабельностью генома, что, предположительно, может говорить о его сравнительно коротком эволюционном пути. В то же время для генотипа Е показана эпидемиологическая связь с HBsAg-негативным вариантом, а также развитием мутаций ЛУ и вакцинного ускользания [22]. Среди обследованных нами ВГВ-инфицированных беременных было выявлено 188 человек (39,17%; 95% ДИ 34,77–43,69%) с неопределяемым HBsAg. Из них 113 женщин были в возрасте до 30 лет, что составило 60,11% (95% ДИ 52,73–67,6%) от всех беременных со скрытым ГВ (скГВ). При этом распределение генотипов вируса при HBsAg-негативных и позитивных случаев не отличалось: p = 0,9914. Так, встречаемость ВГВ генотипа Е составила 92,55% (95% ДИ 87,82–95,87%) среди лиц с скГВ и 93,15% (95% ДИ 89,62–95,77%) – среди HBsAg-позитивных беременных, что сопоставимо с общей представленностью указанного генотипа в обследованной группе – 92,92%. При этом ни нуклеотидные, ни аминокислотные последовательности Pre-S1/Pre-S2/S области ВГВ от лиц с скГВ не показали каких-либо признаков кластеризации, а были распределены среди последовательностей, полученных от HBsAg-позитивных лиц. Филогенетическое дерево, включающее исследованные изоляты ВГВ генотипов A и D, представлено на рис. 4.

 

Рис. 4. Филогенетический анализ нуклеотидных последовательностей полных геномов вируса гепатита В генотипов A и D, выделенных от беременных, проживающих в Гвинейской Республике, в сравнении с представленными в международной базе данных GenBank референсными последовательностями. Референсные последовательности обозначены кодами GenBank с указанием генотипа и региона происхождения образца. Как внешняя группа использована нуклеотидная последовательность вируса гепатита В шерстистой обезьяны AY226578. Исследованные в настоящей работе образцы обозначены белыми (HBsAg+) и чёрными кружками (HBsAg–). Даны значения bootstrap ≥ 70.

 

Фрагмент филогенетического дерева ВГВ генотипа Е представлен на рис. 5.

 

Рис. 5. Филогенетический анализ некоторых нуклеотидных последовательностей полных геномов вируса гепатита В генотипа Е, выделенных от беременных, проживающих в Гвинейской Республике, в сравнении с представленными в международной базе данных GenBank референсными последовательностями. Референсные последовательности обозначены кодами GenBank с указанием генотипа и региона происхождения образца. Как внешняя группа использована нуклеотидная последовательность вируса гепатита В шерстистой обезьяны AY226578. Исследованные в настоящей работе образцы обозначены белыми (HBsAg+) и чёрными кружками (HBsAg–). Даны значения bootstrap ≥ 70.

 

Можно предположить, что встречаемость HBsAg-негативного ГВ у молодых женщин связана с особенностями передачи инфекции в странах Африки, в частности, с преимущественным инфицированием в раннем детстве, в том числе вертикальным путём.

Значительное количество мутаций было обнаружено в MHR и RT-регионе. Генетические изменения, связанные с аминокислотными заменами в домене RT, классифицируют как первичные мутации ЛУ и вторичные компенсаторные мутации, восстанавливающие репликационную способность вируса. В настоящей работе при анализе региона RT генома ВГВ мутации ЛУ вируса были выявлены у 33 человек, что составило 6,88% (95% ДИ 4,78–9,52%) случаев. При анализе 33 изолятов, полученных от лиц с фармакорезистентными вариантами вируса, мутации ЛУ были обнаружены в следующих соотношениях: S78T (27,27%; 95% ДИ 13,3–45,52%), L80I (24,24%; 95% ДИ 11,09–42,26%), S202I (15,15%; 95% ДИ 5,11–31,9%), M204I/V (42,42%; 95% ДИ 25,48–60,78%). При этом у одного человека выявлено сочетание S78T + L204I, у трёх – L80I + M204I/V.

В Гвинейской Республике наиболее распространённым терапевтическим препаратом по отношению к ВГВ является Атрипла (Atripla), включающий эфавиренз, эмтрицитабин и тенофовир, используется также ламивудин. В связи с этим выявление мутаций ЛУ к тенофовиру и ламивудину не вызывает удивления. Однако тенофовир имеет высокий генетический барьер устойчивости и поддерживает эффективное подавление ВГВ как у моноинфицированных, так и у лиц с коинфекцией вирусом иммунодефицита человека (ВИЧ)/ВГВ [13]. Кроме того, все обследованные нами беременные отрицали получение препарата или какое-либо иное лечение. Можно предположить, что источником обнаружения мутаций у терапевтически наивных женщин являлось заражение несущим мутацию вирусом от получавших терапию партнеров с низкой или средней приверженностью к лечению. Ещё одной причиной возникновения таких генетических изменений может оказаться естественный полиморфизм вируса. Косвенно подтверждает это предположение обнаружение мутаций только у пациенток с ВГВ генотипа Е, а также наличие полиморфных вариантов, не описанных как фармакорезистентные, в положениях, связанных с развитием ЛУ к тенофовиру, ламивудину, телбивудину и энтекавиру (L80F, S202I, M204R). В некоторых регионах Африки обнаруженные нами мутации ЛУ встречались у терапевтически наивных лиц гораздо чаще, чем в странах Европы или Америки [13]. Отдельного внимания заслуживает мутация S78T, так как, наряду с повышенной продукцией транскриптов вируса и устойчивой секрецией вирусных частиц при отсутствии антигенных доменов белка S, эта аминокислотная замена может предрасполагать к канцерогенным эффектам [23]. Отметим, что в наших исследованиях вирусного ГВ в Гвинейской Республике таких мутаций не выявлено ранее ни среди ВИЧ-инфицированных лиц, ни среди условно здоровых людей и доноров крови, хотя аминокислотные замены в связанных с ЛУ позициях обнаруживали. Необходимо также сказать, что в то время как для ВИЧ-инфекции определён уровень (> 5%) распространённости первичных мутаций ЛУ у не получавших лечения лиц, выше которого мутации ЛУ ВИЧ представляют собой серьёзное препятствие для успешного лечения на популяционном уровне, требующее введения на территории анализа первичной резистентности у всех инфицированных лиц с последующим выбором схемы терапии, для ВГВ нет рекомендаций по установлению какого-либо конкретного порога распространённости таких мутаций. Представляется очевидным, что определение сходных пороговых значений и рекомендаций для ВГВ могло бы способствовать усовершенствованию анализа эпидемиологической ситуации в том или ином регионе, а также унификации подходов к лечению.

Из-за перекрывания генов, кодирующих RT и HBsAg, мутации ЛУ могут вызывать генетические изменения и в MHR. На сегодняшний день идентифицировано более 30 мутаций HBsAg, приводящих к ускользанию вируса от иммунитета: они позволяют вирусу уклоняться от нейтрализующих антител, способствуют персистентной инфекции ВГВ и приспособляемости вируса. Иммуноассоциированные EM также могут мешать распознаванию HBsAg антителами, индуцированными вакциной, что представляет собой потенциальную угрозу для глобальной программы вакцинации [24].

При анализе MHR и региона детерминанты α, являющейся кластером основных эпитопов B-клеток, расположенных между 124 и 147 (или 149) а.о., мутации выявлены у 318 из 480 беременных (66,25%; 95% ДИ 61,83–70,47%). В 172 случаях из 318 человек с определяемыми мутациями в детерминанте α обнаружены множественные генетические изменения, что составило 54,09% (95% ДИ 48,44–59,66%). Показано наличие замен в 15 позициях, ассоциированных с скГВ и (или) потенциально влияющих на антигенность HBsAg. Наиболее распространённые в обследуемой группе ВГВ-инфицированных беременных клинически значимые мутации представлены в табл. 3.

 

Таблица 3. Наиболее распространённые клинически значимые мутации, выявленные в регионе Pre-S1/Pre-S2/S в обследуемой группе (n = 480)

Table 3. The most prevalent clinically significant mutations identified in the Pre-S1/Pre-S2/S-region sequences from the examined group (n = 480)

Область генома ВГВ HBV genome region	Мутация Mutation	Частота встречаемости в группе Frequency of occurrence in the group	Генотип Genotype
RT	S78T	9 (1,88%; 95% ДИ 0,86–3,53%)	E
RT	L80I	8 (1,67%; 95% ДИ 0,72–3,26%)	E
RT	S202I	5 (1,04%; 95% ДИ 0,34–2,41%)	E
RT	M204I/V	14 (2,92%; 95% ДИ 1,60–4,85%)	E
RT	L80F	17 (3,54%; 95% ДИ 2,08–5,61%)	E
RT	S202R	19 (3,96%; 95% ДИ 2,40–6,11%)	E
RT	M204R	53 (11,04%; 95% ДИ 8,38–14,19%)	E
MHR	Y100C	21 (4,38%; 95% ДИ 2,73–6,61%)	A, E
MHR	M103I	13 (2,71%; 95% ДИ 1,45–4,59%)	E
MHR	I110L	65 (13,54%; 95% ДИ 10,61–16,93%)	А, D, Е
MHR	T116N	58 (12,08%; 95% ДИ 9,30–15,34%)	E
MHR	P120L/S	94 (19,58%; 95% ДИ 16,13–23,42%)	E
MHR	T127P	27 (5,63%; 95% ДИ 3,74–8,08%)	D, Е
MHR	Q129H/R	34 (7,08%; 95% ДИ 4,95–9,76%)	D, Е
MHR	M133I	110 (22,92%; 95% ДИ 19,23–26,94%)	А, D, Е
MHR	Y134H	31 (6,46%; 95% ДИ 4,43–9,04%)	E
MHR	C137Y	46 (9,58%; 95% ДИ 7,10–12,58%)	E
MHR	S140L	19 (3,96%; 95% ДИ 2,40–6,11%)	E
MHR	K141E	39 (8,13%; 95% ДИ 5,84–10,94%)	E
MHR	D144E	15 (3,13%; 95% ДИ 1,76–5,1%)	E
MHR	G145R	28 (5,83%; 95% ДИ 3,91–8,32%)	E
MHR	Y147C	23 (4,79%; 95% ДИ 3,06–7,1%)	E

 

Среди мутаций ЛУ в регионе RT, выявленных в настоящей работе, только две приводят к значимым аминокислотным заменам в S-регионе генома вируса. Так, мутация rtS78T соответствует мутации sC69*, представляющей собой преждевременный стоп-кодон, приводящий к удалению почти всего малого поверхностного белка вируса [23]. В свою очередь, полиморфизм rtM204I/V приводит к двум мутациям в S-гене: sI195M, связанной со снижением реактивности антител к эпитопам в первой или второй петле или в обеих петлях белка [25], и sW196*, приводящей к укорочению С-конца белка, способствующей трансформации клеток и ассоциированной с высоким онкогенным потенциалом за счёт изменённой экспрессии генов хозяина [26, 27].

Ранее было показано, что средняя частота мутаций в гене, кодирующем HBsAg, составляет 11% в популяциях Северной Америки и увеличивается до 47% у больных ХГВ в Южной Корее, а частота мутаций в MHR колеблется от 57,5% для ВГВ генотипа А до 100% для генотипа D, составляя 59,9% для генотипа Е [28], что не противоречит высокому уровню замен, выявленному нами в обследованной группе.

Среди выявленных нами мутаций две (Y100C, M103I) ассоциированы с развитием HBsAg-негативного ХГВ [29]. Мутация I110L связана с резистентностью к иммуноглобулину. Деcять мутаций (T127P, Q129H/R, M133I, Y134H, C137Y, S140L, K141E, D144E, G145R, Y147C) определены в детерминантной области. Отметим, что наиболее распространёнными полиморфными вариантами, связанными с иммунологическим ускользанием и обнаруживаемыми в изолятах ВГВ в генотипе E, являются T116N, P120L/S, Q129H/R, M133I, D144E и G145I [30], однако в обследованной нами группе последние две мутации встречались сравнительно редко. Поскольку MHR состоит из двух петель между cys124 и cys137, а также cys139 и cys147, мутации в этой области разрушают дисульфидные мостики. Исследования предсказания их структуры in silico показали, что трёхмерная конформация экстравирионной петли изолятов с заменами аминокислот между остатками 133 и 144 отличается от конформации генотипа Е дикого типа [31]. Такие замены могут приводить к продукции поверхностного антигена, отличного от обычного и, соответственно, не обнаруживаемого при скринировании [32, 33]. Мутация G145R также может нарушать секрецию HBsAg и приводить к реинфекции в тканях печени, несмотря на защитные титры анти-HBs [34]. Мутация Y147C способствует репликации на стадии синтеза вирусной ДНК и, учитывая необходимость дисульфидной связи Cys-Cys в поддержании конформации для антигенности HBsAg, приводит к прорыву инфекции у вакцинированных больных [35]. Ряд мутаций, потенциально способных влиять на обнаружение HBsAg, были выявлены вне детерминантной области – G159A, E164G, A166V, S167L, A168V [29].

Последовательность генотипа ВГВ, используемого для вакцин, потенциально может влиять на иммуногенность против невакцинных генотипов, но данные, подтверждающие это, ограниченны [36]. Более вероятно, что возникновение ВГВ-инфекции, даже несмотря на иммунопрофилактику, связано либо с вертикальной передачей вируса с ЕМ, либо в результате отбора мутаций de novo, особенно в условиях отсроченной вакцинации. Для предотвращения вертикальной передачи вируса ВОЗ рекомендует, чтобы все новорождённые, независимо от статуса инфицирования матери, получали первую дозу вакцины против ГВ как можно скорее после рождения, предпочтительно в течение 24 ч, а затем 2 или 3 дозы вакцины с интервалом не менее 4 недель, чтобы завершить серию вакцинации [1]. Однако доступ к вакцине при рождении по-прежнему ограничен во многих странах с низким уровнем дохода. Среди 47 стран Африканского региона только 13 внедрили к 2020 г. моновалентную вакцинацию против ГВ, запланированную при рождении [37]. В большинстве же африканских стран, где иммунизация против ГВ только внедряется на государственном уровне, как в Гвинейской Республике, вакцинация откладывается до 6-недельного возраста [38]. Кроме того, трудности проведения своевременной профилактики возникли из-за высокой частоты родов в домашних условиях, отказом матерей приносить новорождённых на осмотр и (или) вакцинацию [39, 40]. Можно предположить, что эта задержка не только создаёт окно для инфекции, но также увеличивает вероятность передачи ЕМ и (или) появления новых мутаций ускользания.

Появление в популяции ЕМ с высокой частотой встречаемости является серьёзной проблемой для лиц с ослабленным иммунитетом, о чём свидетельствует исследование R. Salpini и соавт., продемонстрировавших, что у 75% больных с иммуносупрессией и реактивацией ВГВ несёт по крайней мере одну мутацию в области Pre-S1/Pre-S2/S, преимущественно локализованную в MHR [41].

Отметим при этом, что мутации ускользания от иммунного ответа часто встречаются не сами по себе, а в сочетании со значимыми аминокислотными заменами в генах Pol и Core, связанными с ЛУ вируса или повышенным риском развития цирроза печени и гепатоцеллюлярной карциномы. Поэтому важно понимать функциональные последствия ЕМ для репликации ВГВ, так как их наличие приводит к увеличению распространённости необнаруживаемых вариантов вируса, несущих значимые для лечения и прогрессирования заболевания мутации. Обнаружение сосуществования сложных мутантов ВГВ, например, иммунного ускользания и ЛУ, представляет собой серьёзную проблему, требующую корректировки противовирусной терапии и профилактики инфицирования, так как могут приводить к заболеванию вакцинированных лиц.

Заключение

Хотя информация о генетическом разнообразии ВГВ и клинически значимых мутациях имеет решающее значение для ведения пациентов, эти данные в Гвинейской Республике ограниченны. Учитывая глобальное значение болезни, вызванной данным возбудителем, и многогранное влияние вариаций белка HBsAg на результаты диагностики, клиническое течение и эффективность лечения, всестороннее знание разнообразия и частоты мутаций имеет важное значение. Выявленная среди терапевтически наивных беременных женщин широкая распространённость мутаций иммунного бегства и ЛУ, способных приводить к ложноотрицательным результатам скрининга на HBsAg, безуспешной профилактике и вирусологической неэффективности терапии ВГВ-инфекции, является серьёзной проблемой. Своевременное обнаружение патогена, генотипирование, определение клинически значимых мутаций необходимы для профилактики вертикального инфицирования, лечения заболевания, а также выявления путей распространения вируса и планирования программы иммунизации в Гвинейской Республике.

Об авторах

Терно Амаду Лабе Балде

Исследовательский институт прикладной биологии Гвинеи

Email: thiernoamadoulabe.balde@gmail.com
ORCID iD: 0000-0002-3808-4380

сотрудник

Гвинея, Киндиа

Юлия Владимировна Останкова

ФБУН «Санкт-Петербургский НИИ эпидемиологии и микробиологии имени Пастера» Федеральной службы по надзору в сфере защиты прав потребителей и благополучия человека (Роспотребнадзор)

Автор, ответственный за переписку.
Email: shenna1@yandex.ru
ORCID iD: 0000-0003-2270-8897

к.б.н., старший научный сотрудник лаборатории молекулярной иммунологии, заведующая лабораторией иммунологии и вирусологии ВИЧ-инфекции

Россия, 197101, г. Санкт-Петербург

Санаба Бумбали

Исследовательский институт прикладной биологии Гвинеи; Международный исследовательский центр по тропическим инфекциям в Гвинее

Email: drboumbaly@yahoo.fr
ORCID iD: 0000-0002-4506-6033

к.м.н., заведующий аспирантурой, директор

Гвинея, Киндиа; Нзерекоре

Екатерина Владимировна Найденова

ФКУН «Российский научно-исследовательский противочумный институт «Микроб» Федеральной службы по надзору в сфере защиты прав потребителей и благополучия человека (Роспотребнадзор)

Email: katim2003@mail.ru
ORCID iD: 0000-0001-6474-3696

кандидат биологических наук, ведущий научный сотрудник отдела диагностики инфекционных болезней

Россия, 410005, Саратов

Елена Борисовна Зуева

ФБУН «Санкт-Петербургский НИИ эпидемиологии и микробиологии имени Пастера» Федеральной службы по надзору в сфере защиты прав потребителей и благополучия человека (Роспотребнадзор)

Email: ezueva75@mail.ru
ORCID iD: 0000-0002-0579-110X

к.б.н., биолог отделения диагностики ВИЧ-инфекции и СПИД-ассоциированных заболеваний

Россия, 197101, г. Санкт-Петербург

Елена Николаевна Серикова

ФБУН «Санкт-Петербургский НИИ эпидемиологии и микробиологии имени Пастера» Федеральной службы по надзору в сфере защиты прав потребителей и благополучия человека (Роспотребнадзор)

Email: elena.donetsk.serikova@mail.ru
ORCID iD: 0000-0002-0547-3945

научный сотрудник лаборатории иммунологии и вирусологии ВИЧ-инфекции

Россия, 197101, г. Санкт-Петербург

Диана Эдуардовна Валутите

ФБУН «Санкт-Петербургский НИИ эпидемиологии и микробиологии имени Пастера» Федеральной службы по надзору в сфере защиты прав потребителей и благополучия человека (Роспотребнадзор)

Email: dianavalutite008@gmail.com
ORCID iD: 0000-0002-0931-102X

врач клинико-лабораторной диагностики отделения диагностики ВИЧ-инфекции и СПИД-ассоциированных заболеваний

Россия, 197101, г. Санкт-Петербург

Александр Николаевич Щемелев

ФБУН «Санкт-Петербургский НИИ эпидемиологии и микробиологии имени Пастера» Федеральной службы по надзору в сфере защиты прав потребителей и благополучия человека (Роспотребнадзор)

Email: tvildorm@gmail.com
ORCID iD: 0000-0002-3139-3674

младший научный сотрудник лаборатории иммунологии и вирусологии ВИЧ-инфекции, аспирант

Россия, 197101, г. Санкт-Петербург

Владимир Сергеевич Давыденко

ФБУН «Санкт-Петербургский НИИ эпидемиологии и микробиологии имени Пастера» Федеральной службы по надзору в сфере защиты прав потребителей и благополучия человека (Роспотребнадзор)

Email: vladimir_david@mail.ru
ORCID iD: 0000-0003-0078-9681

младший научный сотрудник лаборатории иммунологии и вирусологии ВИЧ-инфекции, аспирант

Россия, 197101, г. Санкт-Петербург

Елена Владимировна Эсауленко

ФБУН «Санкт-Петербургский НИИ эпидемиологии и микробиологии имени Пастера» Федеральной службы по надзору в сфере защиты прав потребителей и благополучия человека (Роспотребнадзор)

Email: eve-gpmu@mail.ru
ORCID iD: 0000-0003-3669-1993

д.м.н., профессор, заведующая кафедрой инфекционных болезней взрослых и эпидемиологии, заведующая лабораторией «Вирусных гепатитов»

Россия, 197101, г. Санкт-Петербург

Арег Артемович Тотолян

ФБУН «Санкт-Петербургский НИИ эпидемиологии и микробиологии имени Пастера» Федеральной службы по надзору в сфере защиты прав потребителей и благополучия человека (Роспотребнадзор)

Email: otolian@pasteurorg.ru
ORCID iD: 0000-0003-4571-8799

Академик РАН, д.м.н., профессор, заведующий лабораторией молекулярной иммунологии, директор, заведующий кафедрой иммунологии

Россия, 197101, г. Санкт-Петербург

Список литературы

Дополнительные файлы