Новые моноклональные тест-системы для диагностики аденовирусной инфекции

Аннотация

Изучены диагностические свойства новых моноклональных антител (МКА) к гексонному антигену аденовируса и моноклональной иммуноферментной тест-системы (ИФТС) «Аденовир», предназначенной для ранней диагностики аденовирусной инфекции. Полученные ИФТС и коньюгаты новых моноклональных антител для иммунофлюоресцентной диагностики использованы для детекции различных типов аденовирусов в клинических материалах. Обоснована перспективность использования новых тест-систем в клинико-эпидемиологической практике.

Полный текст

Аденовирусы (АВ) представляют собой обширное семейство вирусов (Adenoviridae), патогенных для человека, млекопитающих и птиц. По своей распространенности они занимают третье место после гриппа и респираторно-синцитиальной инфекции. В отличие от эпидемий гриппа, имеющих выраженную сезонность, АВ-инфекции регистрируются на протяжении всего года, вызывая подъем уровня заболеваемости в основном среди детских групп населения [1, 2]. АВ провоцируют тяжелые поражения не только верхних, но и нижних отделов дыхательного тракта в виде пневмоний, бронхитов и бронхиолитов, являются причиной вспышек кератоконъюнктивитов и нозокомиальных заболеваний. Они являются также причиной лимфоаденопатий, острых и хронических тонзиллитов, отитов, фарингитов, протекающих с явлениями интоксикации и гипертермии, поражений печени и миокарда. Отдельные серотипы (31, 40, 41) АВ вызывают вспышки гастроэнтеритов [3]. Тяжелое генерализованное течение АВ-инфекций нередко развивается у пациентов с иммуносупрессией, которым осуществляется трансплантация органов или костного мозга [4]. Создание современных средств химиотерапии определяет необходимость разработки эффективных средств ранней диагностики АВ-инфекции. При создании высокоспецифичных иммунологических тестов, как правило, используют антивирусные моноклональные антитела (МКА), способные обеспечить необходимый уровень стандартизации полученных препаратов [5]. Материалы и методы Клеточные культуры и вирусы. В работе использовали АВ серотипов 3, 4, 6, 7, 14, 19 и 21. Для контроля специфичности реагирования полученных МКА использовали вирусы гриппа А и В, парагриппа и респираторно-синцитиальный вирус (РСВ), а также лизаты клеток HeLa. Накопление биомассы вирусов, очистку и концентрацию вирусов проводили ультрацентрифугированием в градиенте плотности сахарозы согласно [6]. Гексонный антиген (ГА) АВ. АВ 6-го типа осаждали из осветленной вируссодержащей жидкости одновременным добавлением 10% раствора сернокислой меди и 10% раствора бикарбоната натрия. Очистку от солей производили с помощью гель-фильтрации с использованием сефадекса G-25 (Sigma, США). Полученный раствор антигена диализовали против 0,5 моль/л ацетатного буфера (рН 4,6), после чего переносили в колбу и оставляли при температуре 4°С на 2 нед до образования кристаллов ГА в форме тетраэдров, отчетливо видимых при малом увеличении микроскопа (х100). Моноклональные антитела. Для получения иммунных спле- ноцитов гибридных мышей линии SJL/J иммунизировали ГА АВ 6-го типа (штамм Tonsill), смешанным с полным адъювантом Фрейнда из расчета 40 мкг на 1 мышь. Через 6 нед проводили бустер-иммунизацию мышей ГА. Далее МКА получали согласно [7]. МКА 7F1 получены из ОАО «Всероссийский научный центр молекулярной диагностики и лечения» (Москва). Свойства МКА 7F1 описаны ранее [6]. Очистку и концентрацию МКА производили на сефарозе Protein-G. Конъюгацию МКА с пероксидазой хрена (Sigma, США) осуществляли по методу [8], конъюгацию МКА с флюоресцеинизотиоцианатом (ФИТЦ) (Sigma, США) согласно [9]. Выделение аденовирусов в культуре клеток. Для изоляции АВ использовали культуры клеток Hep2 и Vero, которые на 1-2-е сутки роста в среде Игла с добавлением 5% фетальной сыворотки инфицировали материалами от больных ОРВИ, взятыми не позднее 4 сут от начала заболевания. Зараженные клеточные культуры инкубировали при 36±1°С. Образцы ежедневно просматривали в течение 2 нед для выявления цитопатического эффекта с еженедельной заменой поддерживающей среды. Серотип изолята определяли в реакции нейтрализации с использованием типоспецифических сывороток к АВ. Иммуноферментный анализ (ИФА). Для определения специфической активности МКА и их пероксидазных конъюгатов (МКА-ПХ) планшеты сенсибилизировали очищенными вирусными концентратами АВ 3, 6 и 21-го типов, а также ГА в концентрации 2,5-5 мкг/мл. Для контроля специфичности взаимодействия использовали лизат нормальных, не инфицированных клеток HeLa и гетерологичные вирусы (грипп, парагрипп, РСВ). Исследуемые МКА (или МКА-ПХ) разводили в 0,01 М ФСБ-Т (рН 7,2) с 10-1 до 10-7 и вносили по 100 мкл в планшеты, трижды отмытые от несвязавшегося антигена с помощью ФСБ-Т, содержащего 5% желатина. По завершении инкубации (2 ч для МКА и 45 мин для МКА- ПХ при 37°С) и отмывания ФСБ-Т в лунки вносили по 100 мкл 3,3',5,5'-тетраметилбензидина в концентрации 0,1 мг/мл на ацетат-цитратном буфере (рН 5,5), содержащем 0,005 % Н2О2. Реакцию останавливали через 10-15 мин добавлением 50 мкл 1М Н^04. Результаты ИФА учитывали на иммуно- ферментном анализаторе фирмы Anthos (Австрия) при длине волны 450 нм. Титром антител считали последнее разведение, при котором сигнал ОП 450 МКА в 2,5 раза превышал ОП 450 контрольных образцов (ФСБ-Т). Для индикации вирусных антигенов и определения лимита чувствительности иммуноферментных тест-систем (ИФТС) планшеты сенсибилизировали МКА, разведенными на 0,01 М карбонатно-бикарбонатном буфере (рН 9,5) до концентрации (2,5-5 мкг/мл). После инкубации 18 ч при 4°С в отмытые планшеты вносили разведения исследуемых вирусов, контрольные образцы или материалы от больных. После инкубации в течение ночи при 4°С и 4-кратного отмывания ФСБ-Т связанные вирусные антигены выявляли с помощью МКА-ПХ. Метод иммунофлюоресценции (МИФ). Окрашивание препаратов и оценку яркости флюоресценции проводили согласно [10]. В качестве референс-препарата использовали поликлональный препарат «Иммуноглобулин диагностический флюоресцирующий аденовирусный антигексоновый» (ИДФАГ) производства ООО «Предприятие по производству диагностических препаратов» (ООО ППДП) (г. Санкт- Петербург). Тестирование полученных МКА проводили по непрямому методу с использованием антимышиных ФИТЦ- конъюгатов (Sigma, США). Полимеразная цепная реакция (ПЦР). Для выявления специфических последовательностей ДНК АВ в клинических материалах использовали ПЦР-тест-систему «АмплиСенс Adenovirus-462» производства ФГУН «ЦНИИ эпидемиологии» Роспотребнадзора (Москва). Контроль специфичности результатов ПЦР осуществляли с помощью праймеров на ге- терологичные вирусы (ротавирус, торовирус, Норвалка). Электронно-микроскопический (ЭМ) анализ. В работе использовали метод просвечивающей электронной микроскопии (микроскоп JEM-10-11, Япония). Подготовка клинических образцов. Взятие носоглоточных мазков и подготовку препаратов для МИФ проводили согласно [10], образцы фекалий подготавливали, как описано [11]. Определение чувствительности и специфичности разработанных тест-систем. Оценку показателей качества разработанных препаратов проводили в сравнении с методами выделения вируса в культуре клеток, МИФ, ПЦР, а также определяли прирост специфических антител в сыворотках переболевших с помощью ИФА. Расчет показателей чувствительности и специфичности проводили, как описано [12]. Результаты Характеристика МКА к гексонному антигену АВ. С учетом имеющихся литературных данных о высоком консерватизме ГА АВ, общего для разных подродов АВ [13], этот антиген избрали в качестве иммуногена при получении МКА. В работе использовали гибридных мышей линии SJL/J, у которых отмечают ослабленный контроль экспансии В-лимфоцитов, что предполагает синтез более широкого репертуара антител, чем у животных других инбредных линий [14]. Результаты диагностики АВ-инфекции с применением иммуноферментной тест-системы «Аденовир» в сравнении с совокупными результатами других методов) Группа обследованных с симптомами ОРВИ Кол-во обследованных больных Частота выявления, % Диагностические параметры ИФТС "Аденовир" в сравнении с результатами комплекса методов, %* ИФТС "Аденовир" | МИФ чувствительность | специфичность Госпитализированные взрослые 71 45 20 89 81 Госпитализированные дети 88 35 30 92,6 90 Вспышка ОРВИ 22 64 27 100 73 Примечание. * - МИФ, выделение вирусов в культуре клеток, ИФТС-IgG-АД. Для иммунизации мышей в целях получения гибридом использовали кристаллический ГА АВ 6-го типа, который содержал антигенные детерминанты, общие для разных серо- типов аденовирусов. В результате слияния клеток миеломы мышей Рх8Ag.653 с иммунными спленоцитами и их последующего клонирования отобрали семь стабильных клонов гибридом (№ 2, 3, 6, 9, 10, 11, 14), секретирующих антитела к ГА. По показателям специфической активности, оцененной в ИФА и МИФ, из панели МКА для последующих работ по конструированию диагностических тест-систем выбрали МКА 6, которые выгодно отличались от других МКА более широким спектром реагирования в отношении различных серотипов АВ (типы 3, 6, 14, 19, 21), а также высоким уровнем специфической активности в ИФА (титр -10-6) и МИФ (титр в непрямом МИФ 10-3). Специфическую направленность МКА 6 и МКА 7F1 оценивали в конкурентном ИФА. При исследовании систем МКА 6 - конъюгат ПХ-МКА 7F1 и МКА 7F1 - конъюгат ПХ-МКА 6 показано, что немеченые МКА 6 не влияли на связывание с антигеном конъюгатов ПХ-МКА 7F1, а реакцию конъюгатов ПХ-МКА 6 не подавляли МКА 7F1, т.е. они имели разную эпитопную направленность. Показано, что МКА 6 не обладали перекрестной реактивностью с другими возбудителями ОРВИ (вирусами гриппа А и В, РС-вирусом, парагриппа) и антигенами клеток хозяина, хорошо выдерживали процедуры конъюгации с пероксидазой хрена и ФИТЦ, а также лио- филизации. Характеристика спектра реагирования препарата ФИТЦ-МКА 6. Опытные серии ФИТЦ-конъюгатов МКА 6 исследовали на модели клеточных культур, зараженных АВ 6, 3 и 21-го серотипов, а также клеточных культур, инфицированных материалами от больных, среди которых выявлены современные штаммы АВ 2 типа и эпидемически значимых 3, 4 и 7-го типов, принадлежащих, как известно, к различным группам АВ (В, С, Е). Все перечисленные се- ротипы АВ выявляли при окраске ФИТЦ-МКА 6 в виде яркой флюоресценции в ядрах и цитоплазме инфицированных клеток. Клинико-лабораторную апробацию ФИТЦ-МКА 6 провели в сравнении с поликлональным препаратом ИДФАГ (ООО ППДП, Санкт-Петербург) с использованием клинических материалов от 120 детей, госпитализированных по поводу ОРВИ. Чувствительность и специфичность МИФ при использовании ФИТЦ-МКА 6 в сравнении с препаратом ИДФАГ составили 96,7 и 90% соответственно, общее совпадение результатов 95%. Конструирование ИФТС для детекции антигенов аденовирусов. Изготовлены очищенные препараты МКА и перок- сидазные конъюгаты МКА 6 и 7F1, сформированы четыре варианта тест-систем в различных комбинациях МКА и их конъюгатов. Оказалось, что наилучшие результаты достигаются при использовании в ИФТС МКА 6 на стадии захвата (5 мкг/мл) и ПХ-МКА 7F1 (1:800) на стадии детекции. Чувствительность разработанной ИФТС составила 2 нг/мл. Специфичность ИФТС доказана по отсутствию взаимодействия с вышеуказанными гетерологичными вирусами, а также с хозяйскими антигенами. Разработанной тест-системе присвоено название «Аденовир». При оценке чувствительности и специфичности ИФТС «Аденовир» проводили исследование клинических материалов от 181 больного ОРВИ, а также от 35 детей с симптомами острых гастроэнтеритов с параллельным использованием методов выделения вируса в культуре клеток, МИФ или ПЦР, а кроме того, определяли прирост специфических антител в сыворотках переболевших с помощью «Иммуноферментной тест-системы для определения антител класса IgG к аденовирусам» (ИФТС-IgG-Ад) (ООО ППДП, Санкт-Петербург) (см. таблицу). При обследовании детей, госпитализированных с острыми гастроэнтеритами, с помощью ЭМ, ПЦР и ИФТС «Аденовир» совпадение результатов ИФТС «Аденовир» и ЭМ показано в 86% случаев, в том числе по положительным результатам в 76,5% и по отрицательным результатам в 94,5%. Показатели чувствительности и специфичности ИФТС «Аденовир», рассчитанные по отношению к совокупным данным ЭМ и ПЦР, составили 93 и 81% соответственно. Обсуждение Актуальность простых и быстрых тестов лабораторной диагностики АВ-заболеваний определяется необходимостью назначения ранней этиотропной противовирусной терапии и профилактики АВ-инфекций. Разработка современных диагностических подходов осуществляется по двум основным направлениям, первое из которых связано с совершенствованием иммунологических тестов детекции вирусных антигенов или антител, а другое - с выявлением специфических последовательностей вирусного генома в материале от больных. К перспективным иммунологическим тестам относятся ИФА и МИФ, базирующиеся на использовании высокоспецифичной и стандартизованной реагентики моноклонального типа [3]. Применение МКА, направленных к различным сайтам в составе ГА АВ, обеспечивало достижение высокого специфического сигнала и чувствительности при формировании тест- системы «Аденовир». Важной особенностью тест-системы стала ее способность выявлять различные серотипы (3, 4, 6, 7, 14, 19 и 21) АВ, что подтверждено при тестировании музейных культур вируса и результатами типирования вновь выделенных АВ. Чувствительность разработанной ИФТС составила 2 нг/мл и сопоставима с зарубежными аналогами. Например, чувствительность иммунохроматографических тестов «Influenza A Test», «Influenza B Test», «Adenovirus Test» (VEDA- LAB, Франция) составляет 25-100 нг/мл. При сравнении «Adenovirus Test», предназначенного для качественного определения антигена АВ в фекалиях, с ИФА наблюдали 100% корреляцию по чувствительности и специфичности. Экспресс-тест «Адено Стик» (Novamed, Израиль) позволяет выявлять антигены АВ в мазках и смывах с конъюнктивы глаз, носоглотки, мазках из зева, носоглоточных аспиратах и назальных смывах с показателями чувствительности 99% и специфичности 99% по сравнению с таковыми МИФ. В целях определения диагностических параметров ИФТС «Аденовир» провели ее клинико-лабораторные испытания при сопоставлении с результатами, полученными при использовании других диагностических методов (МИФ, выделение вирусов в культуре клеток, ИФА). Частота диагностирования АВ-инфекции по выявлению АВ-антигенов у детей с ОРВИ с использованием ИФТС «Аденовир» и МИФ оказалась примерно одинаковой. В то же время у взрослых АВ-инфекция лучше диагностировалась при использовании ИФТС «Аде- новир», чем при МИФ. Подключение ПЦР к ранее используемым методам показало, что не подтвержденные другими методами результаты тестов МИФ и ИФТС-IgG-Ад находят подтверждение при использовании более чувствительных тестов. В части случаев АВ-антигены выявляли только при применении ИФТС «Аденовир», однако подключение ПЦР к ранее используемым методам свело количество ложноположительных результатов к минимуму - до 4,5%. Известно, что АВ подгруппы F вызывают вспышки гастроэнтеритов и являются причиной длительных диарей у детей младшего возраста. ИФТС «Аденовир» оказалась весьма полезной при расшифровке природы острых гастроэнтеритов у детей в сравнении с менее доступными для практики методами ЭМ и ПЦР. Уровень специфического сигнала при исследовании копрофильтратов в ИФА был значительно выше, чем при исследовании носоглоточных смывов. ИФТС «Аде- новир» оказалась высокоспецифичной и не давала реакций с другими вирусами - возбудителями кишечных инфекций (ротавирус, норовирус, торовирус, коронавирус), которые были выявлены при ЭМ-исследованиях. Заключение Разработаны моноклональные тест-системы для диагностики АВ-инфекций, базирующиеся на использовании им- мунофлюоресцентного анализа и ИФА, которые обладали достаточно высокой чувствительностью и специфичностью, сопоставимой с зарубежными аналогами. Достоинством разработанных МКА и тест-систем на их основе оказалась возможность выявления АВ, принадлежащих к различным подгруппам семейства Adenoviridae.