Эффективность детекции вируса клещевого энцефалита в иксодовых клещах (Acari: Ixodidae) с помощью иммуноферментного анализа и полимеразной цепной реакции в реальном времени

Полный текст

Введение Показатель зараженности клещей вирусом клещевого энцефалита (ВКЭ) имеет огромное значение при составлении эпидемиологической характеристики очага и определении необходимого объема и методов профилактики в эндемичных регионах, а также при определении стратегии индивидуального лечения или профилактики клещевого энцефалита (КЭ) после исследования клещей, снятых с людей. В настоящее время выявление ВКЭ в клещах проводят методами иммуноферментного анализа (ИФА), ОТ-ПЦР и ПЦР с детекцией в реальном времени (ПЦР-РВ). Показатели зараженности клещей, полученные разными методами, существенно различаются. Согласно данным Роспотребнадзора [1], доля вирусофорных клещей по РФ, собранных в апреле-августе 2011 г., составила 0,17% (136 из 78 995 проанализированных) при анализе клещей методом ПЦР и 5,38% (9308 из 172 919 проанализированных) при анализе клещей методом ИФА. С помощью ИФА ВКЭ находят в клещах из районов, где никогда не регистрировались и не регистрируются случаи заболевания КЭ. В данной работе мы провели сравнительную оценку чувствительности и специфичности ИФА и ПЦР-РВ. Материалы и методы Клетки. Перевиваемую культуру клеток почек эмбриона свиньи (СПЭВ) поддерживали при температуре 37°С на среде 199 (ПИПВЭ, Москва) с 5% бычьей сыворотки (Фуро, Россия), как описано ранее [2]. Вирусы. В работе использовали ВКЭ - штамм Абсеттаров (GenBank: AF091005.1; [2]) европейского генотипа, выделенный от больного человека в Ленинградской области, где в основном встречается Ixodes ricinus, а также штамм ЭК-328 (GenBank: DQ486861.1; [3]) сибирского генотипа, первоначально выделенный из пула клещей I. persulcatus в 1972 г в Эстонии. Титрование вируса методом бляшек. Титры вируса определяли методом бляшек под агаровым покрытием в культуре клеток СПЭВ на пластиковых 6-луночных планшетах согласно описанной методике [2, 4]. Титр вируса выражали в количестве бляшкообразующих единиц (БОЕ) в 1 мл вируссодержащего материала. Клещи. Всего в экспериментах использовали 405 самок и 350 самцов клещей из лабораторных культур в первом поколении видов I. ricinus (Калужская, Смоленская области, Ставропольский край), I. persulcatus (республики Карелия и Тыва), Dermacentor marginatus (Карачаево-Черкессия), D. re- ticulatus (Калужская и Смоленская области, Ставропольский край), D. nuttalli (Республика Тыва). Исходные самки клещей проверили на отсутствие зараженности ВКЭ, Borrelia burgdorferi sensu lato, Anaplasma phagocitophylum и Ehrlichia chaffeensis/E.muris с помощью набора серии «МультиПрайм» на четыре инфекции (ФБУН ЦНИИЭ Роспотребнадзора; АмплиСенс® TBEV, B. burgdorferi sl, A. phagocytophillum, E. chaffeensis/E. muris - FL) на основе ПЦР-РВ. Заражение клещей. Заражение клещей проводили парентеральным методом, описанным ранее [4, 5]. Клещам вводили под коксу 4-й пары ног культуральную жидкость инфицированных ВКЭ клеток СПЭВ с разной концентрацией вируса. Штаммом Абсеттаров клещей заражали дозами 4 и 6 lg БОЕ/клещ, а штаммом ЭК-328 - в дозе 2 и 4 lg БОЕ/клещ. Самкам и самцам рода Ixodes вводили по 1 и 0,5 мкл вирусной суспензии соответственно, а клещам рода Dermacentor - по 1,5 мкл. Питание клещей. Для питания клещей рода Ixodes использовали белых беспородных мышей (ФГБУ «Научный центр биомедицинских технологий» РАМН, филиал «Андреевка»). На одну мышь сажали не более двух оплодотворенных самок клещей. Методика питания клещей рода Ixodes описана ранее [4]. Для питания клещей рода Dermacentor использовали кроликов (порода «советская шиншилла», ФГБУ «Научный центр биомедицинских технологий» РАМН, филиал «Элек- трогорский»). На одного кролика сажали всех зараженных ВКЭ клещей (32 самки), а на другого - всех незараженных клещей (16 самок). Перед посадкой клещей на спине у кролика в области лопаток выстригали шерсть по периметру квадрата 5x5 см, куда затем приклеивали заранее сшитый колпачок из ткани такого же размера. После того как клей высыхал (1-2 ч), в колпачок помещали клещей. Каждый день колпачок развязывали, наблюдали за процессом питания клещей и при необходимости снимали их с кролика. Получение клещевых суспензий. Приготовление клещевых суспензий для их дальнейшего исследования с помощью наборов на основе ИФА и ПЦР-РВ проводили согласно соответствующим инструкциям. Для проведения вирусологических исследований клещей промывали однократно в 70% этаноле и двукратно в физиологическом растворе с 0,1% ципрофлоксацином (Dr. Reddys’), индивидуально растирали пестиком в отдельной ступке, добавляли 600 мкл среды 199 на растворе Эрла (ФГУП ИПВЭ) с антибиотиками (смесь 100 ед/мл пенициллина и 0,0001 г/мл стрептомицина) и переносили в пробирки типа эппендорф. Таким образом, для голодных половозрелых клещей родов Ixodes и Dermacentor были получены 0,14 и 0,58% клещевые суспензии из расчета, что средняя масса особи составляет примерно 0,85 и 3,5 мг соответственно. Для полунапитавшихся клещей этих родов были получены суспензии 4,2 и 7,5% при средней массе клещей, питавшихся 3 дня, 25 и 45 мг соответственно. Анализ клещевых суспензий на наличие антигена ВКЭ методом ИФА. Анализ проводили с помощью набора «ВектоВКЭ-антиген» (ЗАО «Вектор-Бест») согласно прилагаемой инструкции. Анализ клещевых суспензий на наличие РНК ВКЭ методом ПЦР-РВ. Перед постановкой ПЦР-РВ проводили выделение РНК из клещевых суспензий с помощью комплектов реагентов для выделения РНК/ДНК «РИБО-преп» (ФБУН ЦНИИЭ Роспотребнадзора) и «РеалБест экстракция 100» (ЗАО «Вектор-Бест») согласно инструкциям. Затем на матрице РНК получали кДНК с помощью набора для обратной транскрипции «РЕВЕРТА-L» (ФБУН ЦНИИЭ Роспотребнадзора). Полученную кДНК использовали для детекции ВКЭ методом ПЦР-РВ с применением наборов «АмплиСенс TBE-FL», «АмплиСенс® TBEV, B. burgdorferi sl, A. phagocytophillum, E. chaffeensis/E. muris - FL» (ФБУН ЦНИИЭ Роспотребнадзора) согласно инструкциям производителя. Также анализ клещей на наличие ВКЭ проводили с помощью набора «РеалБест РНК ВКЭ» (ЗАО «Вектор-Бест») согласно инструкции. Проведение слепого эксперимента. Партии непитавшихся клещей из 40 самцов и 40 самок пяти видов из двух родов заражали парентерально разными дозами ВКЭ европейского (штамм Абсеттаров) и сибирского (штамм ЭК-328) субтипов и формировали из них и незараженных клещей (16 самок и 16 самцов) рандомизированные зашифрованные серии. На 5-е и 6-е сутки после их заражения зашифрованные серии исследовали на наличие ВКЭ в слепом эксперименте коммерческими наборами на основе ИФА и ПЦР-РВ согласно инструкциям. Одну серию клещей исследовали набором на основе ИФА «ВектоВКЭ-антиген» (ЗАО «Вектор-Бест»). Две другие аналогичные серии проанализировали наборами на основе ПЦР-РВ («РеалБест РНК ВКЭ», ЗАО «Вектор-Бест» и «АмплиСенс® TBE-FL», «АмплиСенс® TBEV, B. burgdorferi sl, A. phagocytophillum, E. chaffeensis/E. muris - FL», ФБУН ЦНИИЭ Роспотребнадзора). Часть зараженных клещей были отобраны на те же сроки, заморожены на -80°С и использованы для определения титров вируса. Статистическая обработка. В ходе работы использовали непараметрические критерии Манна-Уитни, Колмогорова- Смирнова, а также угловой критерий Фишера и точный метод Фишера для малых выборок данных. Результаты Таблица 2 Средний геометрический титр ВКЭ в самках и самцах клещей на 5-е и 6-е сутки после заражения Сутки после заражения Половой состав Доза ВКЭ в инокуляте штамм ЭК-328 штамм Абсеттаров 2 lg БОЕ/клетка 4 lg БОЕ/клетка 4 lg БОЕ/клетка 6 lg БОЕ/клетка 5-е Самки 4,5 ± 0,2 4,9 ± 0,4 4,0 ± 0,6 3,8 ± 0,3 Самцы 4,7 ± 0,1 5,0 ± 0,0 4,0 ± 0,8 4,6 ± 0,1 Всего 4,6 ± 0,1 4,9 ± 0,2 4,0 ± 0,5 4,2 ± 0,2 6-е Самки 3,3 ± 0,3 4,3 ± 0,6 2,9 ± 1,3 4,3 ± 0,2 Самцы 2,4 ± 0,3 4,1 ± 0,6 2,5 ± 1,1 3,8 ± 0,3 Всего 2,8 ± 0,2 4,2 ± 0,4 2,7 ± 0,8 4,0 ± 0,2 П р и м е ч а н и е . Статистически достоверные различия получены между: титрами вируса в клещах обоих полов на 5-е и 6-е сутки после заражения для штамма ЭК-328 в дозе 2 lg БОЕ и для штамма Абсеттаров в дозе 4 lg БОЕ (критерий Манна-Уитни; р < 0,002); титрами штамма ЭК-328 на 6-е сутки при заражении клещей разными дозами (критерий Манна-Уитни; р < 0,02). Приготовление материала для исследования. Для оценки эффективности выявления ВКЭ наборами на основе ИФА и ПЦР-РВ использовали наиболее распространенные на территории РФ виды клещей, в которых выявляют ВКЭ (табл. 1). Для парентерального заражения клещей использовали ВКЭ европейского (штамм Абсеттаров) подтипа, который чаще всего выявляют в клещах I. ricinus в юго-западной части РФ, а также штамм ЭК-328 сибирского подтипа, переносимый клещами I. persulcatus. Инфекционная доза штамма Абсет- таров составила 4 и 6 lg БОЕ/клещ, а штамма ЭК-328 - 2 и 4 lg БОЕ/клещ. На 5-е и 6-е сутки после заражения из зараженных и незараженных клещей формировали зашифрованные серии клещей и исследовали на наличие ВКЭ в слепом эксперименте коммерческими тест-системами на основе ИФА и ПЦР-РВ согласно инструкциям. Параллельно для определения титра ВКЭ в клещах на данные сутки после заражения проводили исследование клещевых суспензий из аналогичной серии клещей. Ранее нами показано, что эффективность парентерального заражения клещей близка к 100% [4, 5]. В данном эксперименте при анализе клещевых суспензий методом бляшек эффективность лабораторного заражения клещей была также высокой и составила 96%. Титры вируса в индивидуально исследованных особях варьировали от 2 до 5,9 lg БОЕ/клещ (в одном клеще титр вируса составил 1,5 lg БОЕ). В целом как на 5-е, так и на 6-е сутки титры ВКЭ в клещах были достаточно высокими. При заражении каждым из штаммов разница между средними геометрическими титрами вируса на один срок в разных видах клещей не превышала 1 lg БОЕ, за исключением титра Таблица 1 Средний геометрический титр ВКЭ в клещах разных видов на 5-е и 6-е сутки после парентерального заражения Вид клеща Сутки со дня заражения Средний геометрический титр ВКЭ в клещах, lg БОЕ/клещ штамм ВКЭ ЭК-328 Абсеттаров I. ricinus 5-е 5,0 ± 0,2 4,6 ± 0,1 6-е 3,3 ± 0,4 3,6 ± 0,0 I. persulcatus 5-е 4,3 ± 0,1 4,4 ± 0,1 6-е 2,6 ± 0,5 4,3 ± 0,0 D. marginatus 5-е 4,5 ± 0,3 3,6 ± 0,6 6-е 3,6 ± 0,5 4,0 ± 0,3 D. nuttalli 5-е 4,9 ± 0,0 4,4 ± 0,3 6-е 3,0 ± 0,3 2,7 ± 0,8 D. reticulatus 5-е 4,9 ± 0,2 3,7 ± 0,5 6-е 4,3 ± 0,5 4,6 ± 0,1 Всего... 5-е 4,7 ± 0,1 4,1 ± 0,2 6-е 3,3 ± 0,2 3,6 ± 0,3 Примечание. Статистически достоверные различия получены между: титрами ВКЭ на 5-е и 6-е сутки после заражения (критерий Манна-Уитни; р < 0,001); титрами на 5-е сутки (для I. persulcatus - на 6-е сутки) после заражения клещей штаммами ЭК-328 и Абсеттаров (критерий Манна-Уитни; р < 0,008). Здесь и в табл. 2 титр рассчитан для групп клещей из 2-6 особей. штамма ЭК-328 на 6-е сутки в клещах I. persulcatus по сравнению с таковым в D. reticulatus (разница 1,7 lg БОЕ), и была статистически недостоверной (см. табл. 1). Минимальные титры вирусов наблюдали в D. nuttalli, однако из-за большого разброса показателей в индивидуальных клещах различия были статистически недостоверны. В самцах и самках титры вируса также статистически не различались (табл. 2). На 5-е сутки после заражения титры ВКЭ были примерно одинаковыми в клещах, зараженных разными дозами вируса (см. табл. 2). На 6-е сутки наблюдали снижение титров вируса, причем чем ниже была заражающая доза, тем более выраженным было его снижение. Для доз 2 и 4 lg БОЕ штамма ЭК-328 в инокуляте изменения титра вируса в суспензиях клещей, исследованных на 6-е сутки после заражения, были статистически достоверны (р < 0,02). На 5-е сутки значения титров вирусов в клещах были выше, чем на 6-е (см. табл. 1; р < 0,001). В целом титры штамма ЭК-328 в клещах на 5-е сутки после заражения были достоверно более высокими, чем титры штамма Аббыли практически одинаковыми на день проведения анализа (5-е сутки) (см. табл. 2). Более того, разница в чувствительности ИФА для самок и самцов клещей оказалась статистически достоверна только при применении углового критерия Фишера (р < 0,05). Вероятно, наблюдаемое явление не является закономерностью. Существенное влияние на результат ИФА оказывал субтип использованного для заражения штамма ВКЭ. Так, при дозе обоих штаммов ВКЭ в инокуляте 4 lg БОЕ/клещ доля отрицательных результатов в ИФА при анализе клещей, зараженных штаммом ЭК-328 (сибирский субтип), составила 5,9% (1/17), а среди клещей, зараженных штаммом Абсеттаров (европейский субтип), - 38,9% (7/18) (см. табл. 3). Разница статистически достоверна (точный метод Фишера; р < 0,05). Хотя титры штамма Абсеттаров в клещах на момент анализа (5-е сутки после заражения), по нашим данным, были ниже, чем титры ЭК-328 (4 lg БОЕ против 4,8 lg БОЕ), эта разница статистически недостоверна (р = 0,199). При заражении клещей штаммом ЭК-328 удавалось выявить вирус в 50% клещей, зараженных минимальной дозой 2 lg БОЕ, где титры были даже ниже 3 lg БОЕ/клещ. При анализе клещей, инфицированных штаммом Абсеттаров, получили отрицательный результат даже при заражающей дозе 6 lg БОЕ. Таким образом, субтип ВКЭ в наших опытах влиял на чувствительность ИФА. Заметное влияние на результат ИФА оказывала также исходная доза ВКЭ, вводимая в клеща. Несмотря на то что к 5-м суткам титры вируса были примерно одинаковыми в клещах с различными заражающими дозами, наименьшее количество отрицательных результатов наблюдали при анализе особей с высокой исходной дозой заражения (см. табл. 3, 4). Чувствительность метода ИФА составляла около 50% при титрах ВКЭ в клещах в диапазоне 3-4 lg БОЕ/клещ, т. е. 3,24,2 lg БОЕ на 1 мл клещевой суспензии. сеттаров (р=0,008), хотя на 6-е сутки различия были уже недостоверными. Таким образом, в клещевых суспензиях на момент проведения детекции ВКЭ различными методами вирус присутствовал во всех клещах в количестве более 2 lg БОЕ (за исключением 1 клеща D. nuttalli). Результаты ИФА. Для анализа эффективности набора «ВектоВКЭ-антиген» (ЗАО «Вектор-Бест») использовали клещей, взятых для исследования на 5-е сутки после заражения ВКЭ. Согласно инструкции, к набору возможны два протокола для проведения ИФА - «Инкубация 3 ч» и «Инкубация ночь». По обоим протоколам в слепом эксперименте исследовали 112 клещей: по 30 клещей заразили штаммом ЭК-328, по 50 клещей - штаммом Абсет- таров, 32 особи были интактными. Эффективность (доля правильно определенных результатов во всех пробах) детекции вирусного антигена составила 87,5% при проведении ИФА по протоколу «Инкубация 3 ч» и 88,4% по протоколу «Инкубация ночь». Для ИФА с протоколом «Инкубация 3 ч» ложноположительных реакций выявлено не было. При проведении ИФА по протоколу «Инкубация ночь» на 5% увеличилась чувствительность (доля правильно определенных результатов в группе заведомо положительных проб) детекции ВКЭ в клещах (с 82,5 до 87,5%), но при этом появились ложноположительные результаты (табл. 3-5). Чувствительность детекции ВКЭ методом ИФА не зависела от вида зараженного клеща (см. табл. 3, 4). Отрицательные результаты, полученные при анализе заведомо зараженных особей, наблюдали при исследовании всех видов клещей. По результатам обоих способов проведения ИФА чувствительность метода различалась для клещей разного пола (см. табл. 3, 4). Из 14 отрицательных результатов, полученных в ИФА при анализе зараженных клещей с использованием протокола «Инкубация 3 ч», 10 показали самки клещей и лишь 4 - самцы. Однако титры вируса в особях разного пола Т аблица 3 Вид клещей Половой состав Количество отрицательных результатов в ИФА при данной дозе заражения клещей Количество ложноположительных результатов штамм ЭК-328 штамм Абсеттаров 2 lg БОЕ 4 lg БОЕ 4 lg БОЕ 6 lg БОЕ I. ricinus Самки 1/2 0/2 1/2 0/4 0/4 Самцы 0/2 0/2 0/3 0/4 0/4 I. persulcatus Самки 2/2 1/2 2/2 0/4 0/4 Самцы 1/2 0/2 1/2 0/3 0/4 D. marginatus Самки 0/2 0/2 0/2 0/4 0/4 Самцы 1/2 0/2 0/2 0/4 0/4 D. reticulatus Самки - 0/1 1/1 1/2 0/1 Самцы - 0/1 1/1 0/2 0/2 D. nuttalli Самки - 0/2 1/1 0/3 0/3 Самцы - 0/1 0/2 0/3 0/2 Итого... Самки 3/6 1/9 5/8 1/17 0/16 Самцы 2/6 0/8 2/10 0/16 0/16 И т о г о для клещей 5/12 1/17 7/18 1/33 0/32 Результаты детекции ВКЭ в клещах методом ИФА по протоколу «Инкубация 3 ч» обоих полов... Примечание. Статистически достоверные различия получены между: количеством отрицательных результатов ИФА для клещей, зараженных штаммами ЭК-328 и Абсеттаров в дозе 4 lg БОЕ (точный критерий Фишера; р < 0,05); суммарным количеством отрицательных результатов ИФА для инфицированных самок и самцов (точный критерий Фишера; р < 0,05). Вид клещей Половой состав Количество отрицательных результатов в ИФА при данной дозе заражения клещей Количество ложноположительных результатов штамм ЭК-328 штамм Абсеттаров 2 lg БОЕ 4 lg БОЕ 4 lg БОЕ 6 lg БОЕ I. ricinus Самки 0/2 0/2 1/2 0/4 0/4 Самцы 0/2 0/2 0/3 0/4 0/4 I. persulcatus Самки 2/2 0/2 1/2 0/4 0/4 Самцы 1/2 0/2 1/2 0/3 0/4 D. marginatus Самки 0/2 0/2 0/2 0/4 0/4 Самцы 1/2 0/2 0/2 0/4 0/4 D. reticulatus Самки - 0/1 1/1 1/2 0/1 Самцы - 0/1 1/1 0/2 0/2 D. nuttalli Самки - 0/2 0/1 0/3 2/3 Самцы - 0/1 0/2 0/3 1/2 Итого... Самки 2/6 0/9 3/8 1/17 2/16 Самцы 2/6 0/8 2/10 0/16 1/16 И т о г о для клещей 4/12 0/17 5/18 1/33 3/32 Таблица 4 Результаты детекции ВКЭ в клещах методом ИФА по протоколу «Инкубация ночь» обоих полов... Примечание. Статистически достоверные различия получены между: количеством отрицательных результатов ИФА для клещей, зараженных штаммами ЭК-328 и Абсеттаров в дозе 4 lg БОЕ (точный критерий Фишера; р < 0,05); суммарным количеством отрицательных результатов ИФА для инфицированных самок и самцов (точный критерий Фишера; р < 0,05). Таблица 5 Сводные данные по результатам детекции ВКЭ в клещах методом ИФА Вид клещей Всего проанализировано клещей Количество зараженных клещей (исходно) Количество ложноположительных результатов Эффективность, % инкубация 3 ч инкубация 18 ч инкубация 3 ч инкубация 18 ч I.ricinus 29 21 0 0 90,5 95,2 I.persulcatus 27 20 0 0 65,0 75,0 D.marginatus 28 21 0 0 95,2 95,2 D.nuttalli 17 12 0 3 91,7 100,0 D.reticulatus 11 8 0 0 75,0 75,0 Итого... 112 82 0 3 87,5 89,0 Результаты выявления ВКЭ в клещах с помощью ПЦР- РВ. Для проведения анализа с помощью ПЦР-РВ использовали клещей через 6 дней после заражения. На момент проведения ПЦР-РВ титры ВКЭ в клещах были ниже, чем на момент проведения ИФА (р < 0,001). Несмотря на этот факт, применение двух коммерческих наборов на основе ПЦР-РВ показало практически 100% эффективность детекции ВКЭ в клещах. При анализе в общей сложности 229 клещей были получены 1 отрицательный (набор «АмплиСенс TBE-FL», «АмплиСенс® TBEV, B. burgdorferi sl, A. phagocytophillum, E. chaffeensis/E. muris - FL»; ФБУН ЦНИИЭ Роспотребнадзора) и 1 ложноположительный (набор «РеалБест РНК ВКЭ»; ЗАО «Вектор-Бест») результаты (табл. 6). Отрицательную реакцию дал при анализе самец D. nuttalli, зараженный 2 lg БОЕ штамма ЭК-328. К моменту проведения анализа он был мертв, поэтому, возможно, вирус в нем успел разрушиться. Ложноположительный результат дала самка I. persulcatus из лабораторной культуры. Минимальный титр ВКЭ, который безошибочно выявлялся методом ПЦР-РВ, составил в среднем 2 lg БОЕ/клещ, т.е. 2,2 lg БОЕ на 1 мл клещевой суспензии. Таким образом, эффективность и чувствительность детекции ВКЭ в клещах коммерческими наборами на основе ПЦР- РВ выше, чем наборами на основе ИФА. Результаты детекции ВКЭ в полунапитавшихся клещах. Для проверки влияния степени насыщенности самок кровью на чувствительность и специфичность (доля правильно определенных результатов в группе заведомо отрицательных образцов) детекции ВКЭ самок клещей I. ricinus и D. margi- natus, парентерально зараженных 4 lg БОЕ штаммом ЭК-328, выдерживали в пробирках 4 дня, а затем параллельно с неза- раженными клещами сажали для питания на мышей (I. ricinus) или кролика (D. marginatus). После 3-дневного питания зараженных и незараженных клещей снимали с животных и формировали зашифрованные серии, как в слепом опыте с голодными клещами. Одну серию клещей (16 инфицированных и 7 интактных особей) проанализировали на наличие ВКЭ набором на основе ИФА («ВектоВКЭ-антиген»; ЗАО «Вектор- Бест»), а другую серию - наборами на основе ПЦР-РВ («Ам- плиСенс TBE-FL», «АмплиСенс® TBEV, B. burgdorferi sl, Таблица 6 Сводные данные по результатам детекции ВКЭ в клещах коммерческими наборами на основе ПЦР-РВ (тест-системы «АмплиСенс TBE-FL», «АмплиСенс TBEV, B. burgdorferi sl, A phagocytophillum, E. chaffeensis/E. muris - FL»; ФБУН ЦНИИЭ Роспотребнадзора и РеалБест РНК ВКЭ; ЗАО «Вектор-Бест») Вид клещей Всего проанализировано клещей Количество зараженных клещей Количество ложноположительных результатов Эффективность, % I. ricinus 53 37 0 100 I. persulcatus 56 40 1 100 D. marginatus 56 40 0 100 D. nuttalli 40 28 0 96,4 D. reticulatus 24 16 0 100 Итого... 229 161 1 99,4 A. phagocytophillum, E. chaffeensis/E. muris - FL»; ФБУН ЦНИИЭ Роспотребнадзора). Несколько зараженных полунапитавших- ся клещей оставили для исследования титра вируса в них на момент проведения детекции ВКЭ. Титры ВКЭ в I. ricinus и D. marginatus после 3 дней питания были примерно одинаковыми и составили в среднем 6±0,2 lg БОЕ/клещ, что значительно выше, чем в голодных клещах. Наборы на основе как ИФА, так и ПЦР-РВ показали 100% эффективность, ложноположительных реакций выявлено не было. Обсуждение По нашим данным, метод ИФА оказался менее чувствительным, чем ПЦР-РВ: доля отрицательных результатов при анализе зараженных ВКЭ клещей составила для ИФА 12,5-17,5% против 0,4% для ПЦР-РВ. Применение протокола «Инкубация ночь» при проведении ИФА привело к незначительному повышению чувствительности метода, а также к снижению специфичности реакций. При проведении нами слепых опытов выявили влияние нескольких факторов на эффективность ИФА: заражающей дозы ВКЭ, субтипа ВКЭ и, по-видимому, протокола проведения реакции. Вид и пол клеща существенного влияния на результат ИФА не оказывали. Эффективность детекции ВКЭ в клещах методом ПЦР-РВ не зависела в наших опытах от вышеперечисленных факторов. Метод ПЦР-РВ показал 100% чувствительность при анализе клещей с титром вируса 2 lg БОЕ/клещ и более, тогда как чувствительность метода ИФА была около 50% при титрах ВКЭ в клещах 3-4 lg БОЕ/клещ. Как говорилось ранее, по данным Роспотребнадзора [1], вирусофорность клещей, собранных в природе и снятых с людей, установленная методом ИФА, выше, чем при исследовании с помощью ПЦР и ПЦР-РВ. В результате наших исследований мы так и не выяснили причину этого явления. Можно предположить, что возможными причинами могут быть циркуляция в клещах вариантов ВКЭ, не выявляемых коммерческими наборами на основе ПЦР, или близкого к ВКЭ флавивируса, не вызывающего заболевания у людей, но дающего положительную реакцию при проведении ИФА, а также наличие в клеще агента невирусной природы, имеющего серологический перекрест с ВКЭ. В своих опытах мы использовали культуры клещей, прошедших полную генерацию в лабораторных условиях. При переходе на последующую фазу развития клещи частично теряют бактериальные и вирусные агенты, которыми они, возможно, были заражены в природе. Заключение В результате проведенного исследования с использованием коммерческих наборов для выявления ВКЭ в клещах на основе ИФА («ВектоВКЭ-антиген»; ЗАО «Вектор-Бест») и на основе ПЦР-РВ («РеалБест РНК ВКЭ»; ЗАО «Вектор-Бест» и «АмплиСенс® TBE-FL», «АмплиСенс® TBEV, B. burgdorferi sl, A. phagocytophillum, E. chaffeensis/E. muris - FL»; ФБУН ЦНИИЭ Роспотребнадзора) сделали следующие выводы: • эффективность детекции ВКЭ обоими методами не зависит от пола, вида и степени насыщенности зараженного клеща; • метод ИФА менее чувствительный, чем ПЦР-РВ; • отмечена зависимость чувствительности ИФА от субтипа ВКЭ; • выявлены увеличение чувствительности, но снижение специфичности ИФА при переходе от протокола «Инкубация 3 ч» к режиму «Инкубация ночь».

Список литературы

Дополнительные файлы