Генетическая характеристика штаммов вируса Залив Терпения (ZTV - Zaliv Terpeniya virus) (Bunyaviridae, Phlebovirus, антигенный комплекс Укуниеми), изолированного в высоких широтах Северной Евразии из облигатных эктопаразитов чистиковых птиц (Alcidae Leach, 1820) - клещей Ixodes (Ceratixodes) uriae White, 1852 и от комаров Culex modestus Ficalbi, 1889 в субтропиках Закавказья

Полный текст

Прототипный штамм вируса Залив Терпения (ZTV -Zaliv Terpeniya virus) ZTV / LEIV-21С был впервые изолирован из иксодовых клещей Ixodes (Ceratixodes) uriae White, 1852, собранных в августе 1969 г. на острове Тюлений в заливе Терпения акватории Охотского моря (48°29' с.ш., 144°38' в.д.), в подстилке гнездовой колонии тонкоклювых кайр Uria aalge Pontopiddan, 1763 (Alcidae Leach, 1820) [1, 2]. За рубежом в близких экологических условиях были изолированы родственные вирусы: Гран-Арбо (GAV - Grand Arbaud virus) от Argas reflexus Fabricius, 1794, собранных в январе 1966 г. в голубятне в местности Ка-марг (устье реки Роны, Франция) [3], и Прекариус-Пойнт (PPV - Precarious Point virus) из клещей I. uriae, собранных в ноябре 1975 г. в колонии пингвинов на островах Маккуори в южной части Тихого океана (Австралия) (54°30' ю.ш., 159°00' в.д.) [4]. По данным предварительного изучения методом электронной микроскопии, ZTV был отнесен к сем. Bunyaviridae, методом РСК - к антигенному комплексу Укуниеми (UUKV - Uukuniemi virus) из рода Phlebovi-rus, однако при использовании реакции нейтрализации не удалось выявить связи между ZTV и UUKV [1, 2]. Секвенирование штамма ZTV/LEIV-271Ka из I. uriae, собранных в гнездовых колониях чистиковых птиц (Alcidae Leach, 1820) на острове Арий Камень в августе 1970 г., показало принадлежность этого вируса к группе Укуниеми (Bunyaviridae, Phlebovirus) [5]. UUKV впервые изолирован из клещей I. ricinus Linnaeus, 1758, собранных в 1960 г. с коров в юго-восточной Финляндии [6]. Изолят LEIV-279Az, по данным первичной серологической идентификации охарактеризованный как UUKV, изолирован из комаров Culex modestus Ficalbi, 1889, собранных в августе 1969 г. в колонии цапель (Ardea Linnaeus, 1758) Кызылагачского заповедника, в юго-восточной части Азербайджана [7]. Аналогичные по антигенным свойствам изоляты известны от черного дрозда (Turdus merula Linnaeus, 1758) (1968 г.; штамм LEIV-540Az) [7, 8] и клещей I. ricinus (1969 г.; штамм LEIV-810Az), собранных в предгорных лесах Та-лыша на юго-востоке Азербайджана [9]. В настоящей работе мы определили полные нуклеотидные последовательности генома двух изолятов, которые на основании филогенетического анализа отнесли к ZTV Один изученный штамм LEIV-13841Ka изолирован от клещей Ixodes (Ceratixodes) uriae White, 1852 на острове Арий Камень (Командорские острова) в сентябре 1986 г.. Второй изученный штамм LEIV-279Az (первоначально охарактеризованный как UUKV), согласно данным проведенных исследований, также является ZTV. Таким образом, нами впервые охарактеризован изолят ZTV из субтропической зоны Закавказья, который был изолирован от комаров. Полученные результаты позволяют расширить предполагаемый ареал ZTV и дополнить данные об экологии флебовирусов серогруп-пы Укуниеми и их эволюции. Материалы и методы Вирусные штаммы. Работы с инфекционным материалом, связанные с получением и накоплением виру са, проводили в боксовых помещениях, оборудованных и сертифицированных для работы с микроорганизмами 2-й группы патогенности. Использованные в работе вирусы LEIV-13841Ka и LEIV-279Az получены из Государственной коллекции вирусов РФ при ФГБУ «НИИ виру сологии им. Д.И. Ивановского» Минздрава России в виде лиофилизированной мозговой суспензии. Для накопления вируса лиофилизированную суспензию восстановили в 1 мл культуральной среды ДМЕМ (с добавлением антибиотика) и использовали для интрацеребрального заражения новорожденных беспородных белых мышей. После развития симптомов поражения ЦНС (2-3 сут) мышей забивали в соответствии с правилами содержания и использования лабораторных животных. Выделение РНК. Фрагменты мозга (около 30 мг) помещали в 1 мл реагента TRIzol ("Life Technology", США) и гомогенизировали пластиковым пестиком. Далее выделяли РНК согласно прилагаемой инструкции производителя данного реагента. Конечный осадок суммарной РНК растворяли в 100 мкл DEPC-обработанной воды. Для дополнительной очистки, а также для удаления низкомолекулярных фракций рибосомальной (5S) и транспортной РНК полученный препарат очищали набором “RNeasy mini kit” (QIAGEN, Германия) в режиме cleanup на автоматической станции QIAcube (QIAGEN, Германия) в соответствии с инструкцией. Концентрацию РНК измеряли с использованием флюориметра Qubit ("Invitrogen", США). Для удаления рибосомальной (18S и 28S) РНК использовали набор “GenRead rRNA depletion Kit” (QIAGEN, Германия) в соответствии с инструкцией. Для этого брали не более 3 мкг суммарной РНК. Эффективность деплеции достигала 50-80%, и, таким образом, количество полученной РНК для дальнейшего анализа составило около 300 нг. Подготовка ДНК-библиотек и секвенирование. Для получения кДНК около 100 нг деплецированной РНК фрагментировали в 15 мкл реакционной смеси для обратной транскриптазы с гексапраймером при 85 °С в течение 5 мин, после чего помещали в лед. К фрагментированной РНК добавляли 200 ед. фермента RevertAid Premium ("Thermo Scintific", США) и 20 ед. ингибитора РНаз RNasin ("Promega", США). Инкубировали при 25°С в течение 10 мин, далее при 42°С в течение 60 мин. Реакцию останавливали прогреванием при 70 °С в течение 10 мин Синтез второй цепи кДНК проводили с использованием набора "NEBNext® mRNA Second Strand Synthesis Module" (NEB, США) в соответствии с инструкцией. Полученную дцДНК очищали с использованием набора "MinElute PCR Purification Kit" (QIAGEN, Германия) на автоматической станции QIAcube. Для получения ДНК-библиотек из дцДНК использовали набор "TruSeq DNA Sample Prep Kits v2" ("Il-lumina", США) в соответствии с инструкцией. Для селекции ДНК по размеру использовали реагент “AMpure XP” ("Beckman Coulter", США) с расчетом получения ДНК-библиотек длиной более 270 н.о., что соответствует размеру вставки около 150 н.о. Данные требования к размеру ДНК-библиотек связаны с использованием для секвенирования набора, позволяющего секвениро-вать не более 150 н.о. в одну сторону. Полученные библиотеки визуализировали на станции автоматического электрофореза "QIAxcel Advanced System" (QIAGEN, Германия). Молярность полученных библиотек измеряли методом полимеразной цепной реакции в реальном времени (2х SsoFast EvaGreen Supermix (Bio-Rad, США), прибор Bio-Rad CFX1000) согласно рекомендациям, изложенным в руководстве "Sequencing Library qPCR Quantification Guide" ("Illumina", США). Секвенирование ДНК-библиотек осуществляли на приборе MiSeq ("Illumina", США) с использованием на- 13 Дендрограммы, построенные на основе сравнения нуклеотидных последовательностей буньявирусов животных. а - L-сегмент (RdRp); б - M-сегмент (Gn/Ge); в - S-сегмент (NP). 14 бора “MiSeq Reagent Kits v2 (300PE)” в соответствии с инструкцией производителя. Биоинформационный анализ. Обработку данных полногеномного секвенирования, сборку контигов и картирование ридов проводили, используя программу "CLC Genomics Workbench 5.5" ("CLC bio", США). Предварительный поиск гомологичных последовательностей проводили с использованием сервиса BLASTX (http://blast.ncbi.nlm.nih.gov). Для анализа нуклеотидных и аминокислотных последовательностей использовали пакет программ "Lasergene Core Suite" ("DNAstar", США). Филогенетический анализ и построение дендрограмм осуществляли с помощью программы MEGA5 по методу ближайшего соседа с 1000-кратным бутстреп-тестированием. Выравнивание последовательностей проводили по алгоритму ClustalW. Результаты и обсуждение Вирусы рода Phlebovirus можно разделить на две экологические группы: 1) передаваемые кровососущими комарами (Culicinae) и москитами (Phlebotominae) (mosquito-borne); 2) передаваемые клещами (tick-borne). Между москитными и клещевыми флебовирусами уровень гомологии белков составляет всего около 30%, но они были объединены в один род благодаря наличию антигенных связей и общей структуре генома, который представлен тремя сегментами РНК негативной полярности: L (~ 6500 н.о.), M (~ 3300-4200 н.о.) и S (~ 1800 н.о.). Прототипным вирусом москитных флебовирусов является вирус лихорадки долины Рифт (RVFV - Rift Valley Fever virus), а клещевых - вирус Укуниеми (UUKV). В целом структура генома данных вирусов совпадает, включая размер и канонические концевые последовательности, однако существуют различия в строении их М-сегмента. У клещевых флебовирусов за счет отсутствия неструктурного белка NSm длина М-сегмента короче. Филогенетически флебовирусы также четко разделяются на две ветви в соответствии с указанными экологическими особенностями. К клещевым флебовирусам, кроме группы UUKV, относятся также вирусы серогруппы Бханджа (BHAV - Bhanja virus), вирус лихорадки с синдромом тромбоцитопении (SFTSV) и вирус Heartland (HERV), которые формируют отдельные кластеры (см. рисунок). Согласно G. Palacios и соавт. [5], в серогруппу UUKV входит 15 вирусов, однако с накоплением геномных и серологических данных статус некоторых вирусов может быть пересмотрен. На основе антигенных связей все известные клещевые флебовирусы предлагается объединить в серогруппу UUKV и выделить внутри нее семь видов: UUKV (включает ZTV, CHZV - Chize virus, FINV - Fin virus, и EGAV - EgAN virus), Murre virus (MURV; также включает SCAV - Sunday Canyon virus, и RML-vi-rus), SFTSV, Manawa virus (MNWV), GrandArbaud virus (GAV), BHAV и PPV [5]. ZTV изначально был охарактеризован как вирус, анти-генно близкий вирусу UUKV [1]. Согласно генетическим данным, ZTV обладает с UUKV гомологией 78 и 92% по нуклеотидной и аминокислотной последовательности РНК-зависимой РНК-полимеразы (RdRp), которая является наиболее консервативным геном буньявирусов. Изученные в настоящей работе изоляты LEIV-13841Ka и LEIV-279Az по RdRp практически гомологичны (99%) ранее изолированному штамму ZTV / LEIV-271Ka. На нуклеотидном уровне гомология L-сегмента с LEIV-271Ka составляет 94 и 98% для LEIV-13841Ka и LEIV-279Az соответственно. Основываясь на полученных данных, вирусы LEIV-13841Ka и LEIV-279Az мы классифицировали как изоляты ZTV (см. рисунок, а). Гомология LEIV-13841Ka и LEIV-279Az по сегменту М с ранее секвенированным штаммом LEIV-271Ka составляет 89 и 88% соответственно. При этом по аминокислотной последовательности полипротеина Gn/Gc данные значения составляют 98,3 и 97,7%. По белку ну-клеокапсида (NP) изученные штаммы ZTV LEIV-13841-Ka и LEIV-279Az обладают 88,7 и 84,6% гомологии с LEIV-271Ka и по аминокислотной и нуклеотидной последовательности соответственно. Таким образом, генетическая дистанция между различными изолятами ZTV, выделенными в разных географических зонах, составляет не более 26%. Нужно отметить, что ближайшим к ZTV вирусом является FINV, изолированный в Норвегии. Гомология по аминокислотной последовательности белка NP между ними составляет 93,3%. По оболочеч-ным белкам Gn/Gc и полимеразе RdRp гомология FINV и ZTV не превышает 75 и 80% соответственно (см. рисунок, б, в). На шельфе и островах в акватории Охотского, Берингова и Баренцева морей из I. uriae, собранных в гнездовьях морских колониальных птиц, были изолированы в общей сложности 66 штаммов ZTV. При этом зараженность клещей в европейской части ареала в 6,5 раза выше, чем в дальневосточной (см. таблицу) [10-20]. Два штамма ZTV были изолированы из I. signatus Birula, 1895, собранных на острове Арий Камень (Командорские острова) (55°13' с.ш., 165°48' в.д.), но зараженность этого вида клещей не превышает 1:10 000 (< 0,01%) [17]. Природные очаги ZTV и UUKV, связанные с кровососущими комарами (Culicinae), обнаружены на континентальных территориях в европейской части России, в Мурманской области [18-21]. UUKV изолирован от комаров Aedes flavescens Mtiller, 1764 и Ae. punctor Kirby, 1828 на западе Украины [22], а также на границе Польши и Белоруссии [23]. UUKV широко распространен в средне- и южнотаежном поясах Фенноскандии и прилегающих районах Русской равнины. В среднетаежных ландшафтах восточной Фенноскандии изолированы 12 штаммов UUKV от иксодовых клещей I. ricinus, зараженность которых достигает 0,5 %, и 1 штамм - от комаров Ae. communis [12, 14]. В 1979 г. из клещей I. persulcatus Schulze, 1930, собранных в Белозерском районе Вологодской области, выделены 3 штамма UUKV [15, 24]. В 1970-1971 гг. из клещей I. ricinus Linnaeus, 1758, собранных на территории Литвы и Эстонии, выделены 28 штаммов UUKV [12, 14, 19, 25]. При серологическом обследовании 1004 человек в Литве с помощью РПГА выявлено от 1,8 до 20,9% положительных [26]. UUKV выделен от птиц, клещей I. ricinus в Западной Украине [22]. Клещи I. ricinus Linnaeus, 1758 так же, как I. persulcatus Schulze, 1930, I. pavlovskyi Pomerantzev, 1946, I. nipponensis Kitaoka et Saito, 1967, I. kashmiricus Pomer-antzev, 1948, I. kazakstani Olenev et Sorokoumov, 1934 в нашей фауне I. granulatus Supino, 1897, I. nuttallianus Schulze, 1930, I. hyatti Clifford, Hoogstraal et Kohls, 1971 за рубежом образуют одну филогенетическую ветвь в пределах подрода Ixodes. Происхождение этой группы видов связано с Юго-Восточной Азией. Зоогеографиче-ские данные свидетельствуют о возникновении I. ricinus в палеоцене и тесной связи этого вида с поясом мезо-фильных лесов [27]. В настоящее время этот вид населяет смешанные и широколиственные леса от восточного побережья Атлантического океана до Среднего Поволжья. Результаты сравнительного онтогенетического анализа позволили установить тесные связи этого вида с видами южной ветви группы I. persulcatus (I. kazakstani, I. kashmiricus, I. nipponensis, I. hyatti) и через них с I. pavlovskyi и далее с I. persulcatus. Предполагается, 15 Изоляция штаммов ZIV из облигатных паразитов чистиковых птиц (Alcidae) - клещей Ixodes (Ceratixodes) uriae White, 1852 - в бассейнах Охотского, Берингова и Баренцева морей Дальний Восток Европа бассейн Охотского моря бассейн Берингова моря бассейн Баренцева моря Результат обследования клещей Сахалинская область Камчатский край Чукотский АО Мурманская область остров Тюлений(48°29' с.ш., 144°38' в.д.) остров Ионы (56°24' с.ш., 143°23' в.д.) остров Арий Камень (Командорские острова) (55°13' с.ш., 165°48' в.д.) побережье пролива Беринга(64°50' с.ш., 173°10' з.д.) остров Харлов близ Кольского полуострова (68°49' с.ш., 37°19' в.д.) Количество штаммов 3 2 Уровень вирусофорности, % 0,022 0,103 И то го ... обследовано клещей количество штаммов уровень вирусофорности, % Примечание. АО - автономный округ. что в плиоцене ареал I. ricinus простирался далее на восток, а в плейстоцене получил распространение вместе с широколиственными и смешанными лесами к западу под давлением тайги с севера и степей с юга [27]. Но и в настоящее время вид сохранил связь с ландшафтами, включающими плиоценовые элементы флоры [12]. К периоду формирования современного ареала вида на севере уже существовала экосистема, включающая биоценозы с чистиковыми птицами (Alcidae Leach, 1820), клещами I. uriae и, возможно, ZTV. По мере адаптации ZTV к комарам и клещам I. ricinus в пределах средне- и южно-таежных ландшафтов и могло произойти формирование UUKV и других представителей этой группы с их дальнейшим распространением в прочих экосистемах, в том числе в Закавказье. ZTV, вероятно, обладает более выраженной способностью к репликации в организме комаров, активность которых в условиях Субарктического климатического пояса (тундровые ландшафты) наблюдается в июле - первой половине августа при температурах, достаточных для накопления вируса в слюнных железах гематофагов в титрах, допускающих трансмиссивную передачу [12, 17]. В этот период абсолютно доминируют циркумполярные виды Ae. communis De Geer, 1776, Ae. punctor Kirby, 1828, Ae. hexodontus Dyar, 1916, Ae. impiger Walker, 1848, Ae. nigripes Zetterstedt, 1838, в меньшем количестве встречаются Culiseta alaskaensis Ludlow, 1906 -чрезвычайно агрессивный в отношении человека. Два штамма ZTV изолированы от комаров Ae. communis в тундре Кольского полуострова [12]. При этом по результатам РН среди людей, проживающих в тундровом ландшафте, у 3,3% обнаружены антитела к ZTV, тогда как в лесотундре такие антитела не выявлены [12]. Эти данные свидетельствуют о заражении людей ZTV при его трансмиссивной передаче комарами. Зараженность ZTV нимф и имаго клещей I. uriae в 5 и 13 раз соответственно, ниже, чем имаго. Относительно высокий уровень вирусофорности личинок свидетельствует о высокой (8-10%) частоте трансовариальной передачи вируса [12, 13, 17]. Комплементсвязывающие антитела к ZTV найдены у тонкоклювых кайр (Uria aal-ge) на Командорских островах в 1%, а на европейской части (Мурманская область) - в 6%, у обыкновенных моевок (Rissa tridactyla, 1758) - в 4%, а также у полевок-экономок (Microtus oeconomus Pallas, 1776) - в 1% [12, 13, 17]. Грызуны могут заражаться от погибших от инфекции птиц и в результате передачи ZTV комарами [12, 13, 17]. Данные серологического обследования подтверждают результаты вирусологических исследований о существенно более высокой активности природных очагов ZTV на севере европейской части по сравнению с таковой дальневосточной части ареала. Антитела к ZTV 20 0 41 0,096 < 0,087 0,456 35 725 8994 25 41 0,070 0,456 в РСК на Командорских островах найдены у 1% кайр; на северном побережье Кольского полуострова - у 6 % толстоклювых кайр (Uria lomvia Linnaeus, 1758), у 7% обыкновенных моевок (Rissa tridactyla Linnaeus, 1758), а также у 1% грызунов полевок-экономок (Microtus oeconomus Pallas, 1776) [12, 13]. В условиях южного Азербайджана ZTV циркулирует в системе птицы - клещи I. ricinus с зимней резервацией вируса в клещах. К основному природному очагу примыкают зависимые сезонные очаги в местах скопления колониальных гнездящихся птиц с сезонной циркуляцией вируса. Зондирование территории в высоких широтах Российской Федерации и Закавказья проводили в рамках Программы по биобезопасности и изучению биоразнообразия в различных экосистемах Северной Евразии [10-21, 28], а также для пополнения базы данных по Государственной коллекции вирусов Российской Федерации.

Список литературы

Дополнительные файлы