Оценка коммерческих тест-систем ИФА разного формата для определения уровня специфических IgM и IgG в сыворотках больных корью

Полный текст

Несмотря на то что корь является одним из высококонтагиозных заболеваний, по мнению ведущих специалистов, элиминация коревой инфекции возможна, так как корь протекает в основном манифестно, вирус имеет единственный серотип, единственного хозяина - человека. Кроме того, живая коревая вакцина - это наиболее оптимальное и эффективное средство борьбы с корью [1-5]. С 2000 г. ЕРБ ВОЗ реализует "Стратегическую программу элиминации кори, краснухи и профилактики врожденной крас-нушной инфекции в Европейском регионе к 2015 году". При поддержке ВОЗ на базе Российского национального научнометодического центра (РННМЦ, Москва) по надзору за корью и краснухой в 2003 г. были созданы референс-лаборатория ЕРБ ВОЗ и лабораторная сеть стран СНГ, состоящая из 25 национальных и субнациональных лабораторий. Создание высокопрофессиональной лабораторной сети по кори и краснухе, работающей едиными методами по единому протоколу в единой информационной сети, позволяет получать достоверные результаты и сопоставлять их в рамках общей Европейской программы элиминации кори [6-11]. В 2003-2011 гг. лабораторно обследованы 56 263 больных с подозрением на корь и больных другими экзантемными заболеваниями. Сыворотки большинства (52,9%) пациентов исследованы в субнациональных лабораториях России. Для проведения серологических исследований лабораторная сеть использует стандартный метод иммуноферментно-го анализа (ИФА): с 2003 по 2008 г. тест Enzygnost® AntiMeasles Virus/IgM, Siemens (Германия), а с 2009 г. спектр используемых тестов расширился за счет включения в работу специфических наборов IgM-, IgG-, IgG-avidity фирм-производителей: Vector Best (Россия), Euroimmun (Германия), Virion-Serion (Германия) и др. Использование диагностических наборов разного формата, вовлечение в эпидемический процесс лиц разного возраста и вакцинального статуса [12-16] явились основанием оценки коммерческих тестов разного формата для выявления АТ (АТ) классов M и G в сыворотках больных корью. Материалы и методы Для выявления IgM, IgG и определения степени авидности АТ класса G к вирусу кори в сыворотках крови методом ИФА использовали коммерческие тесты разного формата: непрямой (indirect) и метод двойного сэндвича (capture): - indirect - Enzygnost® Anti-Measles Virus/IgM (Siemens, Германия); - indirect - Anti-Measles Viruses ELISA/IgM (Euroimmun, Германия); - indirect -Virion-Sеrion IgM (Virion-Sеrion GmbH, Германия); - capture - VectoMeasles IgM (Vector-Best, Россия); - capture - Measles IgM EIA (Microimmune Ltd, Англия); - indirect - Enzygnost® Anti-Measles Virus/IgG (Siemens, Германия); - indirect - Anti-Measles Viruses ELISA/IgG (Euroimmun, Германия); - indirect - Virion-Sеrion IgG (Virion-Sеrion GmbH, Германия); - capture - Measles IgG EIA (Microimmune Ltd, Англия); - indirect - Avidity: Anti-Measles Viruses ELISA/IgG (Eu-roimmun, Германия). Исследования проводили на базе референс-лаборатории ЕРБ ВОЗ (г. Москва, Россия) с использованием отдельных аликвот сывороток. Результаты интерпретировали в соответствии с инструкциями на тесты. Статистическую обработку результатов исследования выполняли с использованием методов параметрической статистики с помощью пакетов прикладных программ Statistica for Windows 8.0 (StatSoft®, Inc., США, http://www.statsoft.ru) и SPSS 13.0 for Windows. При этом применяли методы описательной статистики, а также корреляционный анализ и однофакторный дисперсионный анализ [17, 18]. Для проведения исследований использовали 72 сыворотки больных типичной среднетяжелой формой кори из очага инфекции, возникшего в результате импортирования инфекции из КНР. Завозной характер инфекции подтвержден эпидемиологическими данными и результатами генотипирова-ния вируса - выявлен генотип Н1, широко циркулирующий на территории КНР в этот период. Взятие крови у больных проводили в острый период заболевания на 5-6-е сутки после появления сыпи. Больные корью были разного возраста: 4-12 мес (п=29); 1,5-4 года (п=4); 11-14 лет (п=6) и 20-42 года (п=33). Сведения о вакцинации получены из карт эпидемиологического расследования случая больного корью: 29 (40,28%) пациентов не привиты по возрасту (дети до 1 года); 12 (16,67%) имели документально подтвержденную вакцинацию; 11 (15,27%) 2 дозы вакцины; вакцинальный статус 20 (27,78%) не известен. Предварительный анализ результатов исследования сывороток разными тестами (IgM, IgG, авидность IgG) с учетом анамнестических данных позволил разделить пациентов на две группы. В 1-ю группу (п = 41) вошли больные с первичным иммунным Контактная информация: Мамаева Тамара Алексеевна, канд. биол. наук; e-mail: t.mamaeva@gabrich.ru 44 ответом, во 2-ю (п = 31) - со вторичным. Большинство (70,7%) пациентов 1-й группы - это дети до 1 года, не привитые по возрасту. Сведения о вакцинации имели только 4 больных. Средний возраст пациентов 1-й группы составил 6,5 года. Во 2-й группе были больные 11-42 лет (средний возраст 25 лет). Из них 19 (61,29%) имели в прошлом 1 или 2 дозы вакцины. У остальных сведения о вакцинации отсутствовали. Таблица 1 Результаты исследования сывороток у больных на содержание IgM с использованием тестов разного формата (и=72) Результаты Оценка тест-систем для определения уровня IgM. Маркеры острой инфекции (IgM) определены в 100 и 97,2% сывороток больных с помощью тестов формата capture - Vector-Best и Microimmune Ltd соответственно. При использовании тестов формата indirect количество положительных результатов составило 72,2% (Virion-Serion), 68,1% (Siemens) и 63,9% (Eu-roimmun) (табл. 1). Наибольшее количество (13,9%) сомнительных результатов получено в тесте Siemens, а отрицательных (27,8%) - в тесте Euroimmun. В сыворотках 44 больных IgM выявлены всеми используемыми наборами. При постановке ИФА диагностически значимым показателем является оптическая плотность (ОО), которая выражается в оптических единицах (опт. ед.). В табл. 2 представлены результаты сравнительного анализа показателей ОБ, полученных в тестах различного формата. Данные анализа показали не только высокий уровень корреляционной связи всех сравниваемых тестов, но и высокую значимость полученных результатов. Наиболее высокую корреляционную связь при определении коревых АТ класса M в тестах формата indirect выявили между Virion-Serion и Euroimmun (r = 0,89; p = 0,000 <0,05). Среди тестов разных форматов наивысшие значения отметили при сопоставлении данных, полученных в Microimmunc capture и Siemens indirect (r = 0,861; р=0,000 <0,05). Графическая интерпретация этой связи представлена на рис. 1 для 1-й группы больных и на рис. 2 для 2-й. При исследовании сывороток у больных 1-й группы показатели OD IgM, полученные с помощью тестов форматов indirect и capture, были положительными и находились в пределах 0,3-1,3 (0,7±0,03) и 0,7-3,4 (2,5±0,12) соответственно (см. рис. 1). В сыворотках больных 2-й группы по данным теста capture средний показатель OD АТ класса М оказался в 2,5 раза ниже (1,02±0,16), чем в 1-й группе (2,5±0,12); значения QD были положительными в 93,5%; в 2 случаях результат расценили как сомнительный. Крайне низкие данные 0,029-0,85 (0,17±0,03), полученные при использовании теста формата indirect, были интерпретированы как отрицательные и сомнительные в 80,6% случаях (см. рис. 2). При анализе показателей OD IgM, полученных при исследовании сывороток у больных двух групп, выявили статистически значимые различия при использовании всех тестов (табл. 3). Средние значения IgM в сыворотках 1-й группы превышали таковые во 2-й группе в 1,9-4,4 раза. Оценка тест-систем для определения уровня IgG. Исследование 72 сывороток у больных корью на содержание IgG проводили с помощью трех тестов формата indirect: Enzygnost® Anti-Measles Virus/IgG (Siemens), Anti-Measles Viruses ELISA/ IgG (Euroimmun), ^гюп^сгюп IgG (GmbH) - и одного теста формата capture - Measles IgG Microimmune Ltd. При использованиия тестов формата indirect АТ класса G выявили в сыворотках у 69,4-73,6% больных (табл. 4). Количество положительных результатов в тесте формата capture составило 81,9%. Высокий уровень корреляционной связи результатов определения уровня АТ класса G, а также высокая значимость полученных данных демонстрируют возможность использования любого из сравниваемых тестов (табл. 5). Среди наборов разных форматов наивысший показатель обнаружили при сопоставлении OD IgG Microimmunе Ltd/Virion-Serion (r = 0,931; р=0,000<0,05). При сравнении результатов, полученных Положительные Сомнительные Отрицательные Тест, формат количество сывороток % количество сывороток % количество сывороток % Vector-Best, capture 72 100 - - - - Microimmune Ltd, capture 70 97,2 2 2,8 - - Virion-Serion, indirect 52 72,2 2 2,8 18 25,0 Siemens, indirect 49 68,1 10 13,9 13 18,0 Euroimmun, indirect 46 63,9 6 8,3 20 27,8 в Microimmune Ltd/Siemens и Microimmune Ltd/Euroimmun, r = 0,904 и r = 0,881 соответственно (р = 0,000 <0,05). Значения корреляционной связи при определении противокоревых АТ класса G в тестах формата indirect были практически одинаковы: 0,926-0,923 при p = 0,000 <0,05. Результаты анализа показателей значимости результатов OD IgG, полученных при исследовании сывороток (табл. 6), показали, что при использовании тестов разных форматов средние значения находятся в пределах 0,34-1,9 опт. ед. (1-я группа) и 1,94-6,6 опт. ед. (2-я группа). Вместе с тем средние значения OD IgG по данным теста Euroimmun у больных 1-й группы в 2,5-5,6 раза выше результатов, полученных в других изученных тестах. Такую же закономерность выявили и по результатам исследования сывороток у больных 2-й группы, где разница составила 1,8—3,5 раза. Различия в показателях OD IgG двух групп, полученные с использованием наборов Euroimmun, могут свидетельствовать об особенностях конструирования данных наборов. Для оценки количественного содержания IgG использовали данные, полученные с помощью тест-системы Enzygnost® Anti-Measles Virus/IgG (Siemens). В сыворотках у 17 больных 1-й группы IgG не обнаружили. Среднее значение, рассчитанное для 24 сывороток, составило 1,96 ± 0,44 МЕ/мл при стандартном отклонении (о=2,17). В сыворотках у больных 2-й группы АТ класса G определили в высокой концентрации: 27,87±1,59 МЕ/мл (о=8,83), что в 14,2 раза превысило аналогичный показатель в 1-й группе. Определение степени авидности IgG. Степень авидности IgG определили у 24 больных 1-й и 31 пациента 2-й групп (рис. 3). Таблица 2 Параметры корреляционной связи результатов определения содержания IgM, полученных в коммерческих тестах разного формата Тест, формат r p Vector-Best, capture/Microimmune Ltd, 0,764 0,000<0,05 capture Vector-Best, capture/Virion-Serion, indirect 0,783 0,000 <0,05 Vector-Best, capture/Siemens, indirect 0,724 0,000<0,05 Vector-Best, capture/Euroimmun, indirect 0,723 0,000 <0,05 Microimmune Ltd, capture/Virion-Serion, indirect 0,758 0,000<0,05 Siemens, indirect/Euroimmun, indirect 0,849 0,000<0,05 Microimmune Ltd, capture/Siemens, indirect 0,861 0,000<0,05 Microimmune Ltd, capture/Euroimmun, indirect 0,738 0,000<0,05 Virion-Serion, indirect/Siemens, indirect 0,831 0,000<0,05 Virion-Serion, indirect/Euroimmun, indirect 0,890 0,000 <0,05 45 1,41 1,2 1с 0,8- <D I °-6Н О) 0,40,20 0,5 1 1,5 2 2,5 3 IgM Microimmune (OD) 3,5 0,9 0,8 0,7 0,6 0,5 0,4 0,3 0,2 0,1 0 * ♦ ♦< 0,5 1,5 2 2,5 IgM Microimmune (OD) 3,5 Рис. 1. Содержание (в опт. ед.) IgM (OD) в сыворотках у больных корью на 5-6-е сутки после появления сыпи (1-я группа). Здесь и на рис. 2: положительная величина IgM в тесте Siemens indirect = OD > 0,2; положительная величина IgM в тесте Microimmune capture = OD > 0,277. Установили, что АТ класса G, концентрация которых находится в пределах 0,2-6,7 МЕ/мл (1-я группа), были низкоавид-ными 15,77±2,18% (а = 10,67). IgG с показателями 15,6 МЕ/ мл и выше (2-я группа) были высокоавидными 97,34±0,57%, (а = 3,17). Как показано на рис. 3, значения авидности АТ класса G у больных 2-й группы находятся практически на одном уровне. Данное наблюдение, обусловленное формированием у пациентов 2-й группы вторичного иммунного ответа, подтверждается показателем стандартного отклонения от среднего значения авидности IgG у больных 2-й группы, которое в 3,4 раза ниже, чем в 1-й группе. При обобщенном анализе качественных и количественных значений специфических IgM, IgG с учетом вакцинального статуса больных установили, что 1-я (п=41) и 2-я (п=31) группы практически по всем показателям имели значимые различия (табл. 7). В сыворотках у больных 1-й группы выявили IgM у 100% всеми используемыми в данной работе тестами. У пациентов этой же группы определили низкоавидные IgG (15,77±2,18%). Результаты лабораторного обследования больных 2-й группы свидетельствуют о повторной встрече с вирусом кори: АТ класса G с высокой степенью авидности и высокими показателями их концентрации обнаружили во всех сыворотках. Среднее значение IgG составило 27,87±1,59 МЕ/мл (Siemens). Разница между значениями IgG в 1-й и 2-й группах (1,96±0,44 и 27,87±1,59), а также между показателями степени авидности Таблица 3 Показатели OD IgM в сыворотках у больных двух групп, полученные с использованием тестов разного формата Тест, формат Показатель OD IgM в сыворотках у больных: Значимость различий между группами 1-я груп 2-я группа F-критерий; уровень па (n=41) (n=31) значимости (р) Vector-Best, capture 3,23±0,02 1,69±0,18 92,08 (Pos>0,257) 0,0000 (<0,05) Microimmune Ltd 2,5±0,12 1,02±0,16 54,89 capture (Pos>0,277) 0,0000 (<0,05) Virion-Sеrion, 1,75±0,05 0,46±0,08 187,91 indirect (Pos>0,43) 0,0000 (<0,05) Siemens, indirect 0,7±0,03 0,17±0,03 109,64 (Pos>0,2) 0,0000 (<0,05) Euroimmun, indirect 2,89±0,12 0,65±0,12 164,47 (Pos>1,1) 0,0000 (<0,05) Рис. 2. Содержание IgM (OD) в сыворотках у больных корью на 5-6-е сутки после появления сыпи (2-я группа). АТ класса G в этих группах (15,77±2,18 и 97,34±0,57%) статистически достоверна (F= 1632,75; p=0,000 <0,05). Обсуждение Результатом эпидемического неблагополучия по кори в ряде европейских стран и стран СНГ в последние годы стали вспышки инфекции, регистрируемые не только в регионах, которые не достигли 95% охвата вакцинацией, но и в высоковакцинированной популяции [19-21]. В связи с этим важное значение приобретает лабораторная диагностика инфекции, основной целью которой является подтверждение случая кори. Известно, что основными лабораторными маркерами коревой инфекции являются специфические IgM, сероконверсия или 4-кратное нарастание титров IgG, низкая степень авид-ности АТ класса G. Для определения содержания АТ разных классов широко используют метод ИФА, чувствительность и специфичность коммерческих наборов для которого широко обсуждается в литературе [12, 14, 16, 22]. В настоящей работе представлены данные сравнения пяти наборов по определению уровня IgM и четырех наборов для выявления IgG разных форматов и разных производителей. Результаты исследований с использованием сывороток, полученных в активной фазе заболевания от 72 больных корью, показали, что тесты форматов capture и indirect обладают различной способностью выявлять специфические АТ класса М. Процент лабораторного подтверждения диагноза коревой инфекции у больных составил от 63,9 по данным Euroimmun до 100 по результатам Vector-Best (см. табл. 1). По данным, полученным в тестах формата indirect, количество серонегативных в среднем составило 23,6% (см. табл. 1). 120-1 100 80- | бон > < 40 И 20- 10 20 30 N. sera 40 50 60 Рис. 3. Степень (в %) авидности IgG. а - 1-я группа, б - 2-я. Верхняя граница низкоавидных АТ 40%. Нижняя граница высокоавидных АТ 60%. N. sera - число сывороток. 46 Таблица 4 Результаты исследования сывороток у больных на содержание IgG разными тестами (и=72) Положительные Сомнительные Отрицательные Тест, формат количество сывороток % количество сывороток % количество сывороток % Возможных причин не подтверждения кори ^М-тестами формата indirect может быть несколько. Известно, что чувствительность тестов, основанных на использовании нативных и рекомбинантных антигенов ниже, чем чувствительность тестов варианта capture. Это, вероятно, связано с конструкцией последних, где предусмотрены использование моноклональных АТ, "захват" и удаление АТ других классов на первой стадии постановки ИФА. Кроме того, несмотря на использование RF-сорбента в тестах формата indirect, нельзя исключить компрометирующего влияния на выявление IgM высокоавидных АТ класса G. В работе показано, что OD и IgG , полученная при сравнительных исследованиях тестов разного формата, отражает закономерности первичного и вторичного типа иммунного ответа. Средние показатели OD IgМ в 1-й группе (первичный ответ) превышали соответствующие значения во 2-й группе в 1,9—4,4 раза (см. табл. 3). Показатели ОВ IgG Таблица 5 Параметры корреляционной связи результатов определения содержания IgG, полученных в коммерческих тестах разного формата Тест, формат Microimmune Ltd, capture/Virion-Serion, indirect Siemens, indirect/Euroimmun, indirect Microimmune Ltd, capture/Siemens, indirect Microimmune Ltd, capture/Euroimmun, indirect Virion-Serion, indirect/Siemens, indirect Virion-Serion, indirect/Euroimmun, indirect Показатели OD IgG в сыворотках у больных двух групп, полученные с помощью тестов разного формата 0,931 0,000<0,05 0,925 0,000<0,05 0,904 0,000<0,05 0,881 0,000<0,05 0,926 0,000<0,05 0,923 0,000<0,05 Т аблица Тест, формат Показатели OD IgG в сыворотках у больных: Значимость различий между группами 1-я группа (п=41) 2-я группа (п=31) F-критерий; уровень значимости (р) Siemens, indirect 0,34±0,06 2,61±0,07 566,27 (Pos > 0,2) 0,0000 <0,05) Microimmune, 0,74±0,17 3,61±0,06 189,41 capture (Pos > 0,109) 0,0000 <0,05) Virion-Serion, 0,51±0,07 1,94±0,01 346,14 indirect (Pos > 0,34) 0,0000 <0,05) Euroimmun, indirect 1,90±0,28 6,65±0,07 206,12 (Pos > 1,1) 0,0000 <0,05) Siemens, indirect 50 69,4 5 6,9 17 23,7 Еuroimmun, indirect 52 72,2 3 4,2 17 23,6 Virion-Sеrion, indirect 53 73,6 2 2,8 17 23,6 Microimmune, capture 59 81,9 2 2,8 11 15,3 сывороток больных, ответивших на встречу с диким вирусом вторичным типом иммунного ответа, были выше подобных данных в 1-й группе в 3,5-7,7 раза (см. табл. 6). Значимость анализа показателей OD IgM и IgG, полученных при исследовании сывороток у больных двух групп тестами разного формата, высокая и не зависит от формата изученных тест-систем, о чем свидетельствуют значения F-критерия (см. табл. 3, 6). Небезынтересной и практически важной для дифференциальной диагностики кори с другими эк-зантемными заболеваниями является оценка специфичности высокочувствительного теста варианта capture. Результаты наших (неопубликованных) исследований показали высокую специфичность теста Vecto-Measles IgM, с помощью которого в рамках программы проведения активного эпидемиологического надзора в 2010-2011 гг были лабораторно обследованы 6789 пациентов с сыпью и лихорадкой. В сыворотках у 92 (1,36%) больных выявили IgM. В ходе дальнейшего (2-3-кратного) серологического обследования этих больных, а также анализа клинических и эпидемиологических данных результаты интерпретировали как ложные: низкое содержание высокоавидных IgG без нарастания и отсутствие или снижение показателей OD IgM во второй сыворотке. С учетом того, что в эпидемический процесс вовлечены лица разного возраста и вакцинального статуса, лабораторное подтверждение кори целесообразно проводить с использованием тестов варианта capture [23]. Данное заключение справедливо, так как тесты формата capture обеспечивают лучшие условия взаимодействия "антиген-АТ", что повышает эффективность обнаружения специфических противоко-ревых АТ: 100% подтверждение в тесте Vector-Best и 92,8% в тесте Microimmune Ltd. Процент положительных результатов в тестах формата indirect был существенно ниже - 68,1 (Siemens), 63,9 (Euroimmun) и 72,2 (Virion-Serion). В связи с этим использование тестов данного формата свидетельствует о необходимости осторожности в трактовке отрицательных результатов по ^М у больных корью, имевших сведения о вакцинации, а также у лиц с неизвестным прививочным анамнезом. Таким образом, результаты сравнительных исследований коревых тестов для определения уровня IgM и IgG показали: Таблица 7 Результаты лабораторного обследования больных корью Показатель Больные корью 1-я группа (п=41) 2-я группа (п=31) Возраст, годы Средний 6,5 Средний 25 Предел 0,3-35 Предел 11-42 Вакцинальный 1 доза (9,8) 1 доза (25,8) статус Не вакцинирова- 2 дозы (35,5) ны (70,7) Не известен Не известен (38,7) (19,5) IgM Vector-Best + (100) + (100) IgM Microimmune + (100) + (93,5); * (6,5); Virion-Sirion + (100) + (35,5); * (6,5); - (58,0) IgM Siemens + (100) + (25,8); * (32,3); - (41,9) IgM Euroimmun + (100) + (16,1); * (19,4); - (64,5) IgG Siemens, МЕ/ 1,96±0,44** 27,87±1,59 мл, среднее Avidity IgG 15,77±2,18** 97,34±0,57 Euroimmun, %, среднее Примечание. В скобках указан процент. + результат, - - отрицательный, пациентов. положительный - сомнительный; ** - расчет для 24 r 6 47 1) ограничения при использовании IgM наборов формата indirect в диагностике коревой инфекции у больных, имевших в анамнезе противокоревую вакцинацию; 2) статистически значимые различия показателей OD при исследовании сывороток у больных с первичным и вторичным иммунным ответом в тестах IgM разного формата; 3) количественные значения и степень авидности АТ класса G отражают закономерности первичного и вторичного типа иммунного ответа. Авторы выражают благодарность Е.В. Воробейчикову (ФБУН "Санкт-Петерургский НИИЭМ им. Пастера") за математическую обработку полученных результатов.

Список литературы

Дополнительные файлы