Получение моноклональных антител к нуклеопро-теину вируса бешенства

Полный текст

Бешенство - одна из наиболее древних инфекций человека и животных. Вирус бешенства принадлежит к отряду Mononegavirales семейства Rhabdoviridae, род Lyssavirus. Данное острое нейровирусное заболевание передается со слюной человеку и теплокровным животным через укус плотоядных животных, зараженных в природе. Летальность достигает 100% [4, 6]. Глобальный характер распространения лиссавирусов, высокая патогенность для человека и животных, высокая летальность и отсутствие средств лечения развившегося заболевания выдвигают лиссавирусы на первое место среди всех рабдовирусов по их значимости для здоровья человека и животных. С точки зрения анализа последовательности нуклеотидов и аминокислот род Lyssavirus представляет собой наиболее гомогенную и отдаленную от других родов группу вирусов в составе филогенетического дерева Rhabdoviridae [6, 7]. Лиссавирусы являются единственными представителями рабдовирусов, которые поражают исключительно млекопитающих, а их репродукция в ЦНС - свидетельство высшей специализации не только среди семейства Rhabdoviridae [2, 11]. В настоящее время род Lyssavirus представлен 12 видами (генотипами). I вид - вирус бешенства, распространен повсеместно, за исключением Австралии и Антарктиды. II вид - вирус Lagos bat - Африка южнее Сахары. III вид - вирус Mokola - Африка южнее Сахары. IV вид - вирус Duvenhage - Африка южнее Сахары. V вид - лиссавирус европейских летучих мышей 1-го типа - Европа от Испании до Украины. VI вид - лисса-вирус европейских летучих мышей 2-го типа - СевероЗападная Европа. VII вид - лиссавирус австралийских летучих мышей - Австралия. VIII вид - вирус Khujand -Центральная Азия. IX вид - вирус Aravan - Центральная Азия. X вид - вирус Иркут - Восточная Сибирь. XI вид - вирус Shimoni bat - Кения. XII вид - вирус западнокавказских летучих мышей - Юго-Восточная Европа [8, 10, 13]. Таким образом, из 12 лиссавирусов наиболее широкое распространение имеют вирусы бешенства (1-й генотип). Данные вирусы обозначаются как штаммы классического, уличного и дикого вируса бешенства, а также фиксированные (вакцинные) штаммы вируса бешенства. Вирусы бешенства широко распространены среди животных Европы, Азии, Северной и Южной Америки, а также Африки. По данным ВОЗ, от бешенства в мире ежегодно умирают до 100 тыс. человек, причем эти данные отражают далеко не всю реальную картину смертности [2]. Ситуация по бешенству в России самая тяжелая среди развитых и большинства развивающихся стран. На протяжении 20 лет в России регистрируется самая высокая смертность среди развитых стран [2]. По официальным данным Россельхознадзора, в России в 2011 г. заболело 3188 животных, в том числе 1539 диких, 1054 домашних плотоядных, 595 сельскохозяйственных [4]. По данным многолетних наблюдений, заболеваемость среди сельскохозяйственных животных держится на не- Контактная информация: Костина Людмила Владимировна, проф.; e-mail: lvkostina@mail.ru 38 изменном стабильном уровне, основной вклад в рост неблагополучия и заболеваемости вносят домашние и дикие плотоядные. Среди лиссавирусов существует перекрестная антигенная связь на уровне нуклеопротеина. Уровень гомологии последовательностей аминокислот достигает 78-93%. Известно, что нуклеопротеин является важнейшим антигеном рабдовирусов, ответственным за стимуляцию Th-клеточного ответа [15]. Кроме того, в работе B. Dietzschold и соавт. показано, что на нуклеопротеине лиссавирусов находятся главные штаммо- и видоспецифические антигенные детерминанты [9]. Это позволяет создать общий диагностикум для всех лиссавирусов на основе метода флюоресцирующих антител (МФА). К золотому стандарту диагностики бешенства относятся два метода выделения вируса in vivo и in vitro, a также выявление нуклеопротеина вируса прямым методом флюоресцирующих моноклональных антител (МКА). В развитых и большинстве развивающихся стран для диагностики бешенства используют высокочувствительный и высокоспецифичный очень дорогой американский препарат FITC-Anti-Rabies Monoclonal Globulin (Fujirubio Diagnostics, Inc., США) на основе МКА [10, 14]. В России нет современной экспресс-диагностики бешенства, основанной на МКА, из-за чего большое сомнение вызывает достоверность результатов проводимых диагностических исследований [1, 2]. В связи с вышеизложенным цель настоящего исследования заключалась в получении МКА к нуклеопротеину вируса бешенства для создания российского препарата на основе МКА для диагностики бешенства, а также других лиссавирусных инфекций. Материалы и методы Вирусы. Использовали 19 лиссавирусов из коллекции лаборатории иммунологии ФГБУ НИИ вирусологии им. Д.И. Ивановского (табл. 1). Данная группа вирусов включала 14 штаммов уличного вируса бешенства (см. табл. 1, № 1-14), 2 фиксированных штамма вируса бешенства (см. табл. 1, № 15 и 16), а также 3 лиссавируса G4, Юли (G5) - летучая мышь и G5 (см. табл. 1, № 17-19). Животные. Использовали самок мышей линии BALB/c массой 18-20 г, а также беспородных белых мышей массой 8-9 г (питомник "Андреевка", ФГБУ НЦбио-медицинских технологий РАМН). Иммуноген. В качестве иммуногена использовали фиксированный вирус бешенства, штамм CVS, полученный из США проф. М.А. Селимовым в 1964 г. Для приготовления антигена для иммунизации животных проводили внутримозговое заражение мышей линии Balb/c вирусом бешенства, штамм CVS (12 животных). На стадии клинического проявления бешенства (параличи, тремор, взъе-рошенность шерсти, судороги) мышей гуманным способом усыпляли эфиром, стерильно отбирали головной мозг, растирали его в фарфоровой ступке и готовили 10% суспензии мозга на среде ДМЕМ. Полученные суспензии центрифугировали 10 мин при 3000 об./мин. Надосадоч-ные жидкости отбирали и замораживали при -30°С. Приготовление отпечатков мозга мышей для скрининга МКА проводили по методике [9, 14]. Беспородных белых мышей массой 8-9 г заражали интрацеребрально 13 лиссавирусами и на фазе клинических проявлений бешенства животных гуманным способом усыпляли эфиром и извлекали головной мозг в чашки Петри. Мозг мыши разрезали поперек, захватывая пинцетом его половинки, и прикладывали к поверхности предметного стекла, слегка надавливая до получения на стекле тонкого отпечатка. На одном стекле делали 6-8 отпечатков. Иммунизация мышей и получение МКА. Для иммунизации использовали самок мышей линии BALB/c массой 18-20 г. Мозговую 10% суспензию вируса бешенства, штамм CVS, животным вводили внутрибрюшинно по 0,5 мл трехкратно на 0, 9 и 55-е сутки. Активность вируса при введении составила 106 ТЦД 50 мкл/мл. Бустерную инъекцию проводили на 93-е сутки. Через 3 сут проводили гибридизацию спленоцитов иммунизированных животных с клетками мышиной миеломы линии SP2/0-Ag-14. Для слияния использовали PEG/ DMSO Solution (Sigma, США). Гибридизацию проводили по стандартному методу G. Kohler [12]. Через 12 дней выросшие в 96-луночных планшетах клоны тестировали методом непрямого МФА (НМФА). Положительные гибридомные клетки клонировали. Для получения асцитов, содержащих МКА, самкам мышей линии BALB/c, предварительно обработанных пристаном (Sigma, США), вводили внутрибрюшинно по 5-10 млн гибридных клеток. Очистку МКА из асцитической жидкости проводили на протеин-G агарозе (Sigma, США). Концентрацию МКА после очистки измеряли на спектрофотометре при длине волны 280 нм. Субкласс МКА, продуцируемых гибридомными клеточными линиями, определяли с помощью набора Mouse-Hybridoma-Subtyping Kit (Sigma, США). Таблица 1 Использованные в работе лиссавирусы № п/п Вирус Вид Место выделения Источник выделения Год выделения/ получения 1 Волк I Сибирь Волк 1992 2 Собака I Ленинградская область Собака 1992 3 Лиса I Ленинградская область Лиса 1989 4 Барсук I Псковская область, Барсук 1992 5 Шувалов (кошка) I Центральная Россия Человек 2002 6 Енотовидная собака I Новгородская область Енотовидная собака 1982 7 Фролов (лиса) I Кустанай Человек 1976 8 ЯК-ХБ (лиса) I Россия Человек 1971 9 Д2 I Ямал Песец 1974 10 Д42 I Ямал Песец 1974 11 Д474 I Якутия Песец 1974 12 Д1125 I Якутия Песец 1974 13 Д1180 I Якутия Песец 1977 14 G1 I Франция Лиса 2010 15 Flury HEP (вирус фикс.) I США Человек 1969 16 CVS (вирус фикс.) I США Собака 1960 17 G4 - Дувенхейдж IV Южная Африка Летучие мыши 2010 18 Юли (G5) -летучая мышь V Украина Человек 1975 19 G5 V Западная Европа Летучие мыши 2010 39 Конъюгирование МКА класса IgG с флюоресцеинизотиоцианатом (ФИТЦ) проводили по методике [5, 10]. Конъюгирование МКА с флюорофором DyLight 488 осуществляли с помощью набора DyLight 488 Antibody Labeling Kit (ThermoFisher Scientific, США) по методике фирмы-изготовителя. НМФА проводили согласно методике [8, 10]. В работе использовали антимы-шиные иммуноглобулины, меченные ФИТЦ, производства ГУ НИИ эпидемиологии и микробиологии им. Н.Ф. Гамалеи РАМН. Окрашенные отпечатки просматривали в поле зрения люминесцентного инвертированного микроскопа Nikon TS100 (Япония). Прямой МФА проводили согласно методике [8, 9]. На поверхность отпечатка наносили МКА к N-белку вируса бешенства, меченные ФИТЦ-МКА или флюорофором DyLight 488 (DL-МКА), в рабочем разведении 1:50. В качестве положительного контроля использовали американский стандарт - препарат FITC-Anti-Rabies Monoclonal Globulin на основе МКА, меченный ФИТЦ (Fujirebio Diagnostics, Inc., США). Окрашенные отпечатки просматривали в поле зрения люминесцентного инвертированного микроскопа Nikon TS100 (Япония). Реакцию нейтрализации с флюоресцирующими антителами (fluorescent antibody virus neutralisation, FAVN) проводили в культуре клеток ВНК-21 (клон 13) с использованием вируса бешенства, штамм CVS-11, согласно методике, рекомендованной МЭБ [3]. Электрофорез и иммуноблоттинг. Очищенный антиген вируса бешенства (штамм CVS) смешивали в соотношении 1:1 в лизирующем буфере (0,125 М трис-HCl, pH 6,8, 5% ДСН, 0,5% Р-меркаптоэтанола, 10,8% глицерина, 0,01% бромфенолового синего) и прогревали 5 мин при 100°С. Электрофорез полученного материала проводили в пластинах 12% полиакриламидного геля размером 70 * 100 * 0,75 мм на приборе Mini-PROTEAN III (Bio-Rad, США) в восстанавливающих условиях при постоянном напряжении 200 В. Белки в гелях окрашивали в течение 1 ч 0,1% раствором Кумасси ярко-голубого (CBB R-350) в водном растворе, содержащем 10% уксусной кислоты и 45% метанола. После электрофоретическогого разделения белки из геля переносили на ПВДФ-мембрану Immobilon-P (Millipore, США) на приборе Trans-Blot SD (Bio Rad, США) в буфере для электропереноса (0,025 М трис-HCl, 0,193 М глицин, 20% метанол, рН 8,35) при постоянной силе тока 200 мА в течение 1 ч при комнатной температуре. Мембраны блокировали в растворе фосфатносолевой буфер с твином-20 (ФСБТ), содержащем 3% Top Block (Yuro, Швейцария) в течение 16 ч при 4°С, высушивали на воздухе и хранили при 4°С. Для иммунохимической детекции вирусных белков мембраны разрезали на полоски, соответствующие электрофоретическим трекам, и инкубировали с исследуемыми МКА (концентрация 50 мкг/мл в ФСБТ, содержащем 3% Top Block) в течение 1 ч при 37°С. Мембраны отмывали 4 раза в течение 15 мин ФСБТ, добавляли меченные пероксидазой антитела к IgG мыши (разведение 1:10 000 в ФСБТ, содержащем 3% Top Block) и инкуби Таблица 2 Характеристика МкА к вирусу бешества, штамм CVS Активность НМФА МКА Изотип Ig МКА в НМФА (фиксированные отпечатки мозга мыши, ЯК-ХБ) FAVN (CVS-11 1,8 lg Ш50/мл) фиксированные отпечатки мозга мыши Вирус Денге (К-) фиксированные отпечатки мозга незараженной мыши (К-) 2e1 IgG1 3+ 0,17 0 0 2f1 IgG1 2-3+ 0,17 0 0 2f7 IgG1 2-3+ 0,17 0 0 2f9 IgG1 2-3+ 0,17 0 0 2e11 IgG1 3-4+ 0,17 0 0 МКА к N-белку, меченные ФИТЦ*, США (К+) IgG2a 3-4+ 0,17 0 0 Антитела к G-белку вируса бешенства, ВОЗ Н.и. Н.и. 1,49 Н.и. Н.и. Примечание. * - К+, МКА к N-белку, меченные ФИТЦ, использовали только в прямом МФА. Здесь и в табл. 4: Н.и. - не исследовано. ровали 1 ч при 37°С. После отмывания мембраны обрабатывали 3,3’-диаминобензидином (0,05% раствор в ФСБ с 0,01% H2O2). Результаты и обсуждение После бустерного введения вируса (штамм CVS) титр антител к нуклеопротеину вируса бешенства в гипе-риммунных сыворотках мышей в НМФА определили как 10-3. В ходе проведенной гибридизации получили 119 гибридных клеточных линий, устойчивых к селективной среде НАТ. При первичном тестировании культуральных жидкостей отобрали 17 гибридных клонов, продуцирующих МКА, которые специфически окрашивали внутриклеточные включения разной формы и размера в фиксированных ацетоном отпечатках ткани мозга мышей, зараженных вирусом ЯК-ХБ в реакции НМФА. С целью стабилизации культуральных свойств и специ- Рис. 1. Иммуноблоттинг с МКА 2e11 к N-белку вируса бешенства (Штамм CVS). 1, 5 - маркеры молекулярных весов; 2 - отрицательный контроль (МКА к N-белку вируса PRRS); 3 - МКА 2e11; 4 - очищенный вирус бешенства, электрофорез в 12% ПААГ. Результаты иммуноблоттинга с МКА 2e1, 2f1, 2f7 и 2f9 не представлены. 40 Т аблица 3 Диапазон взаимодействия МКА с различными лиссавирусами в НМФА № п/п Вирус МКА Американский стандарт (К+), МФА 2f1 2e1 2f7 2a9 2e11 1 ЯК-ХБ (лиса) 2-3+ 3+ 2-3+ 2-3+ 3-4+ 3-4+ 2 Шувалов (кошка) 3+ 1-3+ 2-3+ 2-3+ 3+ 1-2+ 3 Д1125 1+ 1-2+ 1+ 1+ 2-3+ 1-3+ 4 Д474 2+ 1-2+ 1-2+ 1-2+ 3+ 3+ 5 Барсук 0 0 1-2+ 1+ 3-4+ 3-4+ 6 Фролов (лиса) 0 2+ 0 1+ 1-2+ 2+ 7 Волк 0 0 0 1-2+ 2-3+ 3+ 8 Собака 0 0 0 0 3-4+ 3+ 9 Лиса 0 0 0 0 1-2+ 2-3+ 10 G1 0 0 0 0 1-2+ 2+ 11 Flury HEP (вирус фикс.) 0 0 0 0 2-3+ 1-3+ 12 G4 - Дувенхейдж 0 0 0 0 1-2+ 1-3+ 13 Юли (G5) -летучая мышь 0 0 0 0 2+ 1+ 14 G5 0 0 0 0 2+ 1-2+ 15 Д2 0 0 0 0 0 1+ 16 Д42 0 0 0 0 0 1+ 17 Енотовидная собака 0 0 0 0 0 1+ 18 Вирус Денге (К-) 0 0 0 0 0 0 19 Отпечатки мозга незаражен- 0 0 0 0 0 0 ной мыши (К-) фической секреции иммуноглобулинов провели двукратное клонирование гибридом методом предельных разведений. Большинство гибридных клеток оказались нестабильными по продукции МКА. В результате клонирования отобрали 5 гибридом, стабильно продуцирующих МКА, специфически окрашивающих внутриклеточные включения вируса ЯК-ХБ, подобно американскому стандарту в НМФА. Для того чтобы оценить перспективы использования полученных гибридом, провели первоначальную оценку МКА. Характеристики МКА представлены в табл. 2. Установили, что все гибридомы продуцировали антитела класса IgG. Все полученные МКА обладали высокой активностью в НМФА и демонстрировали четкую окраску внутриклеточных включений вируса бешенства, штамм ЯК-ХБ. Все отобранные МКА в реакции нейтрализации FAVN в культуре клеток ВНК-21 не нейтрализовали (0,17 МЕ/ мл) вирус бешенства, штамм CVS-11, тогда как антитела к гликопротеину достоверно трехкратно превышали (1,49 МЕ/мл) минимально необходимый уровень (0,5 МЕ/мл) нейтрализации вируса. Исходя из данных реакции нейтрализации, можно предположить, что полученные нами МКА направлены не к гликопротеину вируса бешенства [3]. Показано, что все полученные МКА так же, как и американский стандарт (положительный контроль), не окрашивали фиксированные ацетоном отпечатки головного мозга мышей, зараженных неродственным вирусом Денге, а также отпечатки мозга не зараженных вирусом бешенства мышей (отрицательный контроль). Как известно, американский стандарт представляет собой смесь двух МКА, меченных ФИТЦ и направленных к N-белку вируса бешенства, которые в фиксированных ацетоном отпечатках ткани головного мозга любого больного бешенством животного или человека специфично окрашивают нуклеопротеиновые внутриклеточные включения [10, 15]. Представленная выше информация, а также тот факт, что все полученные в работе МКА, подобно американскому стандарту, в НМФА окрашивают такие же внутриклеточные включения в фиксированных ацетоном отпечатках ткани мозга мышей, позволяют предположить, что полученные нами МКА специфически взаимодействуют с нуклеопротеином вируса бешенства, штамм ЯК-ХБ. Точную идентификацию вирусного белка, с которым взаимодействовали полученные МКА, провели методом иммуноблоттинга (рис. 1). Все МКА давали специфическую полосу окрашивания в области 55 кД, что соответствует расчетной молекулярной массе N-белка вируса бешенства [2]. Таким образом, SDS-электрофорезом в денатурирующих условиях и иммуноблоттингом установлено, что МКА всех изученных клонов связываются с антигенными детерминантами, расположенными на N-белке вируса бешенства, что говорит о их высокой специфичности. Для того чтобы оценить перспективы использования Рис. 2. Включение вируса бешенства (Шувалов-кошка) в отпечатках мозга мышей. а - МФА, положительный контроль (Fujirebio, США) (ув. 1000); б - НМФА с МКА 2e11 (ув. 1000); в - МФА с МКА 2e11 (конъюгат 2e11-DyLight 488) (ув. 1000). 41 Рис. 3. Включения вируса бешенства (барсук) в отпечатках мозга мышей. а - МФА, положительный контроль (Fujirebio, США) (ув. 1000); б - НМФА с МКА 2e11 (ув. 1000); в - МФА с МКА 2e11 (конъюгат 2e11 DyLight 488) (ув. 1000). полученных МКА для создания диагностикума против бешенства, необходимо определить спектр их специфичности к циркулирующим в природе вирусам [14]. Уровень взаимодействия МКА с различными лиссави-русами изучали в НМФА в фиксированных ацетоном отпечатках головного мозга мышей, зараженных 17 лис-савирусами, в сравнении с американским стандартом. В качестве отрицательного контроля использовали фиксированные ацетоном отпечатки головного мозга мышей, зараженных неродственным вирусом Денге, а также отпечатки головного мозга не зараженной вирусом бешенства мыши. Результаты представлены в табл. 3. Установили, что 4 МКА (2e1, 2f1, 2a9 и 2f7) реагируют с N-белком лишь нескольких штаммов вируса бешенства. Диапазон взаимодействия данных МКА с антигенными детерминантами N-белка варьирует от 4 до 7 вирусов бешенства. МКА 2е11 специфически взаимодействовали с 11 вирусами бешенства, циркулирующими на территории бывшего СССР и Франции, а также с 3 лиссавирусами: вид G4 (Дувенхейдж), циркулирующий на юге Африки; вид G5 - лиссавирус Европейских летучих мышей 1-го типа, циркулирующий в странах Т аблица 4 Специфичность связывания немеченных и меченных флюорохромами ФИТЦ и DyLight 488 МкА 2e11 с различными лиссавирусами в МФА № п/п Вирус К+ (американский стандарт) (рабочее разведение 1:50) НМФА 2e11 (рабочее разведение 1:50) МФА-ФИТЦ 2e11 (рабочее разведение 1:50) МФА-DyLight 488 2e11(рабочее разведение 1:50) 1 ЯК-ХБ (лиса) 3+ 3-4+ 1+ 2+ 2 Собака 2+ 3-4+ 2+ 3+ 3 Шувалов (кошка) 2+ 3+ 2+ 2-3+ 4 Лиса 2-3+ 2-3+ 1+ 3+ 5 Барсук 3+ 3-4+ 2+ 3+ 6 Д1125 2-3+ 2-3+ 1+ 3+ 7 Д474 1+ 1-2+ 1+ 3+ 8 Фролов (лиса) 2-3+ 1-2+ 1-2+ Н.и. 9 Волк 2-3+ 2-3+ 1+ 1+ 10 Енотовидная собака 1-2+ 0 0 0 11 G1 1-2+ 1-2+ 1+ Н.и. 12 G4 - Дувенхейдж 2+ 1-2+ 0 0 13 Юли (G5) - летучая мышь 1+ 1+ 0 1+ 14 G5 1-2+ 1-2+ 0 0 Примечание. Н.и. - не исследовано. Западной Европы; вирус "Юли" (G5), циркулирующий на территории Украины. Такое широкое взаимодействие МКА клона 2е11 с лиссавирусами позволяет предположить, что данные МКА распознают группоспецифические антигенные детерминанты на N-белке. Следует отметить, что все полученные МКА не взаимодействовали с вирусом енотовидной собаки, циркулирующим на территории Центральной России, а также 2 вирусами Д2 и Д42, циркулирующими на севере России. В то же время при сравнительном анализе интенсивности свечения внутриклеточных включений 14 лиссавирусов, с которыми взаимодействовали МКА 2е11, установили, что данный показатель для МКА 2е11 по меньшей мере не уступает американскому стандарту (см табл. 3). Поэтому все дальнейшие исследования проводили с МКА 2е11. Данные МКА были наработаны в виде асцитических жидкостей, очищены с помощью аффинной хроматографии и сконцентрированы. Представляло интерес сравнить специфичность связывания МКА 2е11 с N-белком вируса бешенства в прямом МФА и НМФА. Для этого препараты МКА 2е11 конъюгировали с ФИТЦ и DyLight 488 флюорохромами и протестировали с 14 лиссавирусами. Результаты представлены в табл. 4. Установили, что специфичность связывания МКА 2е11 в НМФА с наиболее распространенными в России вирусами бешенства (ЯК-ХБ (лиса), Барсук, Шувалов (кошка) и Собака) превосходит препарат США (см. табл. 4, рис. 2, 3). Однако при конъюгировании МКА 2е11 с флюорохромами ФИТЦ и DyLight 488 происходило изменение специфичности связывания МКА с N-белком лиссавирусов. Интенсивность свечения МКА 2е11,конъюгированных с ФИТЦ, в большинстве случаев уступала как МКА 2е11, меченным флюорохромом DyLight 488, так и американскому стандарту. Возможно, при связывании используемых нами флюоресцентных меток с МКА несколько снижается способность МКА распознавать эпитоп нуклео-протеина вируса бешенства. При сравнительном анализе интенсивности свечения МКА 2е11, меченных флюорохромами ФИТЦ и DyLight 488, видно, что меченные DyLight 488 мКа 2е11 превос- 42 ходят по специфичности ФИТЦ-конъюгат. Кроме того, специфичность связывания конъюгата DyLight 488 с 5 вирусами бешенства (Барсук, Шувалов (кошка), Собака, Д 1125, Д 474) превосходила или по крайней мере не уступала американскому аналогу. Эти данные свидетельствуют о перспективности конъюгата DyLight 488. Таким образом, можно заключить, что МКА 2е11 как в НМФА, так и меченные флюорохромом DyLight 488 по специфичности связывания с наиболее распространенными на территории России вирусами бешенства не уступают американскому аналогу (стандарту).

Список литературы

Дополнительные файлы