Гуморальный и клеточный иммунный ответ у людей к вирусу гриппа А/ Калифорния/ 07/ 2009 (H1N1) - A(H1N1)pdm2009

Полный текст

В XX веке зафиксировано 4 пандемии гриппа А: в 1918 г. - А(НШ1), в 1957 г. - А(Н2Ш) и в 1968 г. -А(Н3№). Кроме того, вирус А(НШ1) рециркулировал в 1977 г. после 20-летнего перерыва. В начале 2009 г. сначала в Центральной Америке, а затем в остальных регионах планеты распространились вирусы типа А/ Калифорния/2009 (НШ1) - обобщенное название А(Н1Ш)р^2009. Молекулярно-генетический анализ показал, что они являются реассортантами между человеческим, птичьим и свиным вирусами гриппа А(НШ1) [27]. Начало пандемии сопровождалось высокой смертностью среди населения Мексики и США [24]. Опираясь на совокупность имевшихся на тот момент молекулярно-генетических и клинических данных, ВОЗ объявила высшую (шестую) степень опасности для человечества, а вирус А(НШ1)р^2009 был отнесен к особо опасному возбудителю нового пандемического цикла XXI века [23]. При этом тот факт, что вирусы подтипа А(НШ1) циркулируют среди населения уже многие десятки лет, не был принят во внимание. Последующие события доказали далеко не полную состоятельность этого прогноза, поскольку локальные эпидемии в разных странах, в том числе в России, протекали по вполне умеренному типу [1, 25]. Естественно, возник вопрос, почему же новый вирус А(НШ1) не вызвал ранее прогнозируемую эпидемиологическую ситуацию. В настоящей статье сделана попытка проанализировать этот вопрос с иммунологических позиций. Материалы и методы Обследованные контингенты людей. Антигемаг-глютинирующие антитела к разным штаммам вируса гриппа А(НШ1) определены в 656 одиночных сыворотках крови лиц, родившихся в 1902-2010 гг. (табл. 1). Сыворотки отобраны по остаточному типу Контактная информация: Найхин Анатолий Нойевич, д-р мед. наук, проф.; a.n.naykhin@gmail.com 38 Таблица 1 Обнаружение антител к вирусам гриппа А(НШ1) в одиночных сыворотках крови лиц разного возраста до (осень 1995-1997 гг.) и после (лето 2010 г.) эпидемии гриппа А(Н1N1)pdm2009 Годы рождения обследо- Число исследованных Количество лиц с титром антител > 1:20 по данным РТГА, абс. (%) сывороток крови А/свинья/1976/1931 А/Соломоновы острова/03/2006 А/Калифорния/07/2009 ванных лиц 1995-1997 гг. 2010 г. 1995-1997 гг. 2010 г. 1995-1997 гг. 2010 г. 1995-1997 гг. 2010 г. 2000-2010 - 77 - 5 (6,5) - 45 (58,4) - 23 (29,9) 1990-1999 32 119 0 21 (17,6) 0 26 (21,8) 0 65 (54,6) 1980-1989 38 60 0 5 (8,3) 0 38 (63,3) 0 17 (28,3) 1950-1959 30 62 0 19 (30,7) 0 11 (17,7) 0 6 (9,7) 1940-1949 25 49 0 13 (26,5) 0 10 (20,4) 0 4 (8,2) 1930-1939 24 39 0 8 (20,5) 0 9 (23,1) 0 3 (7,7) 1920-1929 30 21 4 (13,3) 12 (57,1) 0 10 (47,6) 2 (6,6) 4 (19,0) 1902-1919 50 - 31 (62,0) -0 - 12 (24,0) - Примечание . Прочерк означает, что проведение подобных исследований невозможно. Таблица 2 Продукция антител к вирусам гриппа А(НШ1) у лиц разного возраста, привитых сезонной ЖГВ в 1995-1997 гг. и в 2003-2009 гг. Годы Возраст на момент привив- Количество 4-кратных и больших приростов титров антител (I), абс. (%), и средний геометрический титр антител после прививки (II) по данным РТГА рождения привитых лиц Годы прививки* Число лиц А/ свинья/1976/1931 А/Новая Каледония/29/1999 А/Соломоновы острова/03/2006 А/Калифорния/07/2009 ки, годы I II I II I II I II 1994-2002 7-15 2009 18 0 5,3 н. и. н. и. 10 (55,5) 87,1 2(11,1) 8,8 1984-1993 15-23 2007 45 0 5,7 25 (55,5) 115,8 23 (51,1) 97,7 7 (15,6) 10,6 1980-1985 16-23 2003 25 0 5,1 13(52,0) 37,8 6 (24,0) 24,3 0 6,2 1940-1949 43-57 1995-1997 25 0 8,7 4(16,0) 6,6 0 5,0 0 5,0 1930-1939 56-67 1995-1997 22 0 7,8 8(36,4) 11,3 0 5,3 0 5,0 1920-1929 66-77 1995-1997 23 4(17,4) 14,4 5(21,7) 9,1 0 5,8 1 (4,3) 6,8 1910-1919 76-87 1995-1997 40 13(32,5) 30,8 8(20,0) 9,8 0 6,6 5(12,5) 17,1 П римечание . * - вакцинные штаммы: 1995-1997 гг. - А/17/Техас/91/1/3, 2003 г - А/ Новая Каледония/99/145(Н1Ш), 2007 и 2009 гг. - А/17/ Соломоновы острова/06/9 ( Н1Ш); н. и. - не исследовали. в осенний период 1995-1997 гг. и летом 2010 г. от лиц, обследованных в диагностических центрах Санкт-Петербурга по поводу соматических заболеваний. Те же антитела к разным штаммам вируса гриппа А(НШ1) выявлены в 198 парных сыворотках крови лиц, родившихся в 1910-2002 гг., которые принимали участие в испытаниях различных живых гриппозных вакцин (ЖГВ) в 1995-2009 гг. (табл. 2). Сывороточные и локальные антитела к вирусу А/Калифорния/07/2009 (Н1Ш), а также вирусспеци-фические СD4+ и СD8+ Т-клетки памяти протестированы в парных образцах крови 25 добровольцев 18-20 лет, которым вводили осенью 2009 г. живую гриппозную моновакцину "Инфлювир" (производство НПО "Микроген", Иркутск), приготовленную из упомянутого выше штамма. Прививка осуществлена двукратно с интервалом 21 день. Парные образцы крови у вакцинированных лиц отбирали до и через 21 день после прививки. Все испытания вакцин проводились с разрешения Комиссии по гриппозным вакцинам и диагностическим штаммам при Минздраве России с обязательной подписью относительно информированного согласия участников или их родителей. До исследования сыворотки крови хранились в рефрижераторе при -700С, а мононуклеа-ры периферической крови - в жидком азоте. Реакцию торможения гемагглютинации (РТГА) выполняли по общепринятой методике с использованием 4 АЕ антигенов и 1% взвеси эритроцитов человека группы крови 0(I) [2]. При постановке реакции были использованы следующие антигены: А/свинья/1976/1931(Н1Ш), А/Новая Кале-дония/29/1999(НШ1), А/Соломоновы острова/03/ 2006(Н1Ш) и А/Калифорния/07/2009(Н1Ш). Иммуноферментный анализ (ИФА). Локальные IgA-антитела в секретах носа определяли по ранее описанной методике [6]. В качестве антигена применен штамм А/17/Калифорния/2009/38 (Н1Ш). Методика определения вирусспецифических OD4+ и OD8+ Т-лимфоцитов. Применяли традиционную методику, основанную на внутриклеточном окрашивании цитокинов [15]. Мононуклеары периферической крови выделяли стандартным способом [10], крио-консервировали и хранили в жидком азоте до момента анализа. Размороженные клетки каждого образца делили на 2 части, одну из которых инкубировали с 4000 АЕ очищенного в градиенте плотности сахарозы вируса А/ 17/ Калифорния/ 2009/ 38(Н1Ш), а вторую - с таким же объемом RPMI 1640 (негативный контроль). Анализ проводили на проточном цитофлюо-риметре Coulter EPICS Altra ("Beckman Coulter", Майами, США) после окраски клеток моноклональными 39 антителами к СD3 (PE-Cy5-labeled anti-CD3, "BD Biosciences", Сан-Хосе, США), CD8 (Phycoerythrin-Texas Red-labeled anti-CD8, "Beckman Coulter", США) и ИФН-у (FITC-labeled anti-IFN-y. "BD Biosciences", Сан-Хосе, США). Процент специфических к вирусам гриппа А(Н1Ш) ИФГ-у+ лимфоцитов определяли для следующих субпопуляций клеток: СD4+ Т-клетки (IFN-y+ СD3+ CD8-) и CD8+ Т-клетки (ИФН-у+ СD3+ CD8+). За достоверные увеличения уровней клеток принимали результаты, превышающие среднее значение по группе плацебо на 2 и более стандартных отклонения и более. Статистический анализ результатов проводили с использованием критериев Вилкоксона и Г-теста. Достоверными считали результаты при р < 0,05. Результаты До начала распространения вирусов А(Н1Ш) pdm2009 (1995-1997 гг.) антитела в титрах > 1:20 к штаммам А/ свинья/1976/1931(Н1Ш) и А(Н1Ш) pdm2009 тестировались только у лиц, родившихся до 1930 года прошлого века, а антитела к штамму А/ Соломоновы острова/03/2006 (НШ1) не были выявлены у лиц всех возрастных групп (см. табл. 1). После эпидемии в Санкт-Петербурге (лето 2010 г.) ситуация существенно изменилась. Среди лиц, родившихся в 1980-2010 гг., значительно увеличилось количество имевших титр антител > 1:20 к вирусу А(Н1N1)pdm2009 - от 28 до 55% серопозитивных. В других возрастных группах такое увеличение было выражено намного слабее (8-19% серопозитивных). Обращает на себя внимание тот факт, что появились антитела к вирусу А/свинья/1976/1931 (НШ1) у лиц, родившихся в 1930-2010 гг., у которых в доэпидеми-ческий период они не выявлялись. Повозрастные се-рограммы в отношении выявления антител к вирусам А(НlN1)pdm2009 и А/ Соломоновы острова/03/2006 (НШ1) оказались сходными, но количественно показатели к последнему штамму были выше. 3,46 % 1,00-] 0,900,800,700,600,500,400,30- 0,20- 0,10 0,00 CD4 Т-клетки Ї-СІЙ<° 0/-Ч- ?°о.оо^ о-TqO см см см см И П П □ m л I Т I I Г I I I I І I—Ґ CD8 Т-клетки t- Г** о" о' - т- со ' ’“І- см о о Индивидуальные уровни CD4+ и CD8+ Т-клеток иммунологической памяти, специфичных к вирусу гриппа А/Калифорния/07/2009 (H1N1), в довакцинальных образцах крови молодых людей 18-20 лет (n = 25). Образцы крови отобраны в октябре 2009 г., т. е. до начала эпидемии гриппа А (H1N1) в Санкт-Петербурге. По данным опроса, никто из волонтеров не переносил острые респираторные инфекции в течение трех месяцев до отбора образцов крови; по оси ординат - % клеток. В целом результаты исследования сывороток крови лиц, вакцинированных в 1995-1997 гг., совпали с данными выявления антител у невакцинированных людей в тот же период времени (см. табл. 2). Так, поствакцинальные конверсии антител к вирусу А/ свинья/1976/1931 (НШ1) и А(Н1N1)pdm2009 наблюдались только у лиц, родившихся до 1930 г. Не были обнаружены конверсии антител к вирусу А/ Соломоновы острова/03/2006 (Н1Ш). Важно отметить, что у небольшой части детей и молодых людей, родившихся в 1984-2002 гг. (11-16%, р < 0,05), иммунизация сезонными ЖГВ осенью 2007 г. и весной 2009 г. сопровождалась конверсиями антител к вирусу А(Н1Nl)pdm2009, т. е. в период до начала его распространения на территории России. У прививавшихся в 2003 г. вакцинным штаммом А/17/ Новая Каледония/99/145 это не наблюдалось. По данным, отраженным на рисунке, более чем у половины молодых людей, образцы крови которых были отобраны до эпидемии гриппа А(Н1N1)pdm2009, выявлялись перекрестно реагирующие СD4+ и СD8+ Т-клетки памяти, специфические к этому штамму. Диапазон уровней этих клеток колебался весьма значительно. Данные, приведенные в табл. 3, свидетельствуют о том, что двукратная прививка моновалентной ЖГВ, приготовленной из штамма А(Н1N1)pdm2009, активно увеличивала у добровольцев уровень вирусспе-цифических СD4+ и СD8+ Т-клеток памяти (соответственно в 3 и 2,5 раза, р < 0,001). Обсуждение В исследованиях 80-х годов прошлого века нами было показано, что у лиц, больных гриппом А (НШ1) и А (ffiN2) и вакцинированных разными гриппозными вакцинами, конверсии антигемагглютинирующих сывороточных антител к ранее циркулировавшим штаммам этих подтипов наблюдаются лишь в тех возрастных группах, которые встречались с этими штаммами в период их предшествовавшего эпидемического распространения [3-5]. При этом к штаммам, которые либо прекратили активную циркуляцию до рождения этих людей, либо включились в циркуляцию спустя годы после отбора сывороток крови в конкретных возрастных группах, такие конверсии отсутствовали. На основе этих данных было сформулировано положение о возможности использования сведений об анамнестическом гуморальном иммунном ответе у людей в качестве надежного маркера антигенного родства вирусов гриппа А по поверхностным белкам, более информативного, чем результаты, получаемые в перекрестных реакциях с гипериммунными сыворотками животных. В целом результаты настоящей работы подтверждают приведенные выше положения. Так, в 1995-1997 гг. наличие антител (см. табл. 1) и их поствакцинальные конверсии (см. 3nS°o5 о OooSSc 40 Таблица 3 Поствакцинальный гуморальный и Т-клеточный иммунный ответ у добровольцев 18-20 лет, привитых двукратно моновалентной ЖГВ* Показатели гуморального и клеточного иммунитета Группа Число средний геометрический титр антител средний арифметический % вирусспецифических Т-клеток лиц сывороточные антитела по данным РТГА локальные IgA-антитела по данным ИФА Œ4+ Œ8+ I II III I II III I II III I II III Привитые ЖГВ 16 5,7 13,7 2,4 9,1 15,9 1,8 0,167 0,499 3,0 0,118 0,293 2,3 Получившие 9 6,9 7,3 1,1 9,3 6,9 0,7 0,196 0,121 0,6 0,267 0,156 0,6 плацебо Примечание. * - вакцинный штамм А/17/Калифорния/2009/38 (Н1Ш); I - до вакцинации; II - через 21 день после повторной вакцинации; III - кратность изменения (частное от деления II на I). табл. 2) к вирусу А/свинья/1976/1931 (НШ1) были зафиксированы только у лиц, родившихся в 20-х годах прошлого века, особенно до 1920 г. Однако в тот же отрезок времени подобное не наблюдалось в плане обнаружения антител к вирусу А/ Соломоновы острова/03/2006 (НШ1), вступившему в циркуляцию намного позднее отбора исследованных образцов сывороток крови. Нами получены данные, свидетельствующие о способности дрейфовых вариантов вируса гриппа А(НШ1), циркулировавших до эпидемического распространения вируса А(Н1N1)pdm2o09 в 2009-2010 гг., индуцировать как гуморальный, так и клеточный иммунитет к этому штамму. Это подтверждается следующими результатами: - во-первых, обнаружением еще в 1995-1997 гг. антител к штамму А(Н1N1)pdm2009 у пожилых людей, родившихся в 1920-1929 гг., особенно в 1902-1919 гг. (см. табл. 1). Такие же антитела выявлены у престарелых людей из США, Новой Зеландии, Канады и Западной Европы в сыворотках крови, которые были отобраны в 2002-2008 гг. [8, 11, 14, 19-22]. - во-вторых, выявлением в 2007 и 2009 гг. конверсий антител к вирусу А(Н1N1)pdm2009 у небольшой части молодых людей и детей, привитых входившим в состав ЖГВ штаммом А/Соломоновы острова/03/2006(Н1Ш) (см. табл. 2). При этом в 1995-1997 и 2003 гг. подобные конверсии у лиц того же возраста отсутствовали. Аналогичные конверсии наблюдались у молодых добровольцев, иммунизированных в США и Сингапуре разными гриппозными вакцинами в 2007-2009 гг. [9, 14, 21, 28]. - в-третьих, наличием у молодых людей 18-20 лет до начала циркуляции вируса А(НШ1^ш2009 специфических к нему СD4+ и СD8+ Т-клеток иммунологической памяти (см. рисунок). Эти клетки, но в более высоких концентрациях, были выявлены в доэпидемический период у лиц в возрасте 50-96 лет в ходе совместной работы с американским Центром по контролю за заболеваемостью в Атланте (неопубликованные данные). Такие перекрестно реагирующие клетки проявляли специфичность преимущественно к консервативным эпитопам внутренних белков вируса гриппа А [13]. Таким образом, по собственным и полученным за рубежом иммунологическим данным, вирусы типа А(НШ1^ш2009 начали пандемическое распространение в условиях, когда значительная часть населения имела В- и/или Т-клеточную иммунологическую память к этим возбудителям, индуцированную цирку ляцией предшествующих вариантов вируса А(НШ1). Циркуляция не могла не повлиять на заболеваемость в период первой волны пандемии гриппа 2009-2010 гг. Она характеризовалась традиционным преимущественным поражением детей и молодых людей и в целом очень незначительно превышала ординарные показатели [1, 8, 16, 17, 25, 26]. Кроме того, 1/3 из них переносили заболевание без клинических проявлений, но с достоверным приростом титра сывороточных антител [21, 29]. Это свидетельствует о том, что они обладали иммунологической памятью к возбудителю, вызывавшему эпидемию 2009-2010 гг. Нами получены, хотя и косвенные, но вполне убедительные иммунологические данные, свидетельствующие об антигенном родстве гемагглютинина штаммов А/свинья/1976/1931 (Н1Ш) и А(Н1N1)pdm2009. Это подтверждается, во-первых, сходной тенденцией в обнаружении в 1995-1997 гг. перекрестно реагирующих антител (см. табл. 1) и их поствакцинальных конверсий (см. табл. 2) к этим двум штаммам у лиц, родившихся до 1930 г.; во-вторых, появлением антител к вирусу А/свинья/1976/1931 (Н1Ш) после эпидемии гриппа А(Н1N1)pdm2009 среди возрастных контингентов, у которых они никогда ранее не обнаруживались [3-5], поскольку эти лица родились значительно позднее прекращения циркуляции "свиного" штамма. Зарубежные молекулярно-генетические и/или сероэпидемиологические исследования также свидетельствуют об антигенном родстве этих двух штаммов [12, 18]. Все вышесказанное указывает на появление нового феномена в антигенной эволюции вируса гриппа А(НШ1) - способности изменять антигенный профиль гемагглютинина в обратном (реверсном) направлении, т. е. в сторону родства со штаммами, которые давно выбыли из циркуляции. До этого фиксировались антигенные изменения гемагглютинина новых дрейфовых вариантов только в направлении эволюционного отдаления от предшествующих вариантов. Нельзя исключить, что реверсный феномен является еще одним механизмом совершенствования агрессии вируса, направленной на преодоление популяционного иммунологического барьера. По нашим данным, значительный прирост уровня сывороточных антител к вирусу А(НШ1^ш2009 в постэпидемический период в сравнении с предэпиде-мическим отмечен только в возрастных группах 7-23 года, в которых школьники составляли подавляющее большинство (см. табл. 2). Такие же результаты получены норвежскими и канадскими учеными [19, 20, 22]. Однако затруднительно точно ответить на во 41 прос, связано ли это с более высокой заболеваемостью школьников или с большим охватом их противогриппозными прививками. Подводя итог, необходимо подчеркнуть, что, по нашему глубокому убеждению, при возникновении в будущем угрожающих или настораживающих ситуаций в отношении вновь выделяемых вирусов гриппа А элементы прогноза развития эпидемиологического процесса должны строиться не только на молекулярно-генетических данных о родстве нового вируса с другими антропонозными и/или зоонозными разновидностями вируса этого подтипа, но прежде всего на данных сероэпидемиологических и иммунологических исследований. Такие исследования должны отвечать на главный вопрос - как популяция в целом и ее отдельные возрастные контингенты воспринимают антигенные эпитопы нового вируса с точки зрения их способности (или неспособности) индуцировать вирусспецифическую В- и Т-клеточную иммунологическую память, являющуюся главным протективным компонентом противовирусного иммунитета. Этим должны заниматься национальные лаборатории, которые располагают банками сывороток крови и владеют методами быстрого типирования таких клеток.

Список литературы

Дополнительные файлы