Получение и антигенная характеристика рекомбинантных нуклеокапсидных белков вирусов Ласса и Марбург

Аннотация

Созданы векторные конструкции, позволяющие экспрессировать рекомбинантные полипептиды вирусов Ласса и Марбург в прокариотических клетках E. coli, штамм BL21(DE3). Полученные рекомбинантные полипептиды способны связывать специфические антитела, что позволяет использовать их в качестве антигенных компонентов иммуноферментных диагностических тест-систем.

Полный текст

Ызывает летальность в природных очагах, локализованных в странах центральной части Западной Африки, в пределах 5-20% [3, 5, 6]. В других странах практически ежегодно отмечаются случаи заноса этих инфекций. По Контактная инфорация: Владыко Александр Станиславович, д-р мед. наук, проф., рук. лаб.; e-mail: vladyko@belriem.by 41 скольку методы специфического лечения и профилактики данных геморрагических лихорадок не разработаны, единственными действенными средствами являются своевременная диагностика, изоляция больного и симптоматическое лечение. Цель настоящих исследований - получить рекомбинантные диагностически значимые белки данных возбудителей и оценить их антигенные свойства. Материалы и методы Сыворотки крови, использованные в работе, получены от реконвалесцентов, перенесших геморрагические лихорадки Марбург, Ласса, денге, Крымскую-Конго геморрагическую лихорадку (ККГЛ), геморрагическую лихорадку с почечным синдромом (ГЛПС). Клинический диагноз указанных заболеваний был подтвержден лабораторно с использованием молекулярно-биологических и серологических методов. Сыворотки реконвалесцентов (4 сыворотки), содержащие антитела к вирусу Ласса, получены от д-ра G. van der Groen (Институт тропической медицины, Бельгия), сыворотки реконвалесцентов (также 4), содержащие антитела к вирусу Марбург, получены от д-ра T. Fredeking (“Antibody Systems Incorporated Ltd”, Техас, США), сыворотки реконвалесцентов (6), содержащие антитела к вирусу денге, получены от д-ра M. Teixeira (Университет Белуоризонти, Бразилия), сыворотки, содержащие антитела к вирусу ККГЛ (4), получены от д-ра А. М. Бутенко (Институт вирусологии им. Д. И. Ивановского, Россия), сыворотки, содержащие антитела к вирусу ГЛПС (6), получены из Республиканского центра гигиены, эпидемиологии и общественного здоровья, Минск. В качестве отрицательного контроля (К-) использовали нормальную сыворотку человека. Выделение вирусной РНК. В качестве исходного материала для выделения РНК были использованы лиофиль-но высушенные вирус Марбург, штамм Voege с исходным титром вируса 5,4 lg и вирус Ласса, штамм Josiach с исходным титром вируса 6 lg. Указанные штаммы вирусов были взяты из специализированной коллекции вирусов и бактерий, патогенных для человека, Республиканского научно-практического центра эпидемиологии и микробиологии. Выделение РНК осуществляли из восстановленной в 0,2 мл H2O вирусной суспензии с помощью коммерческого набора реагентов NucleoSpin RNA (MACHERY-Nagel) согласно прилагаемой инструкции. Получение фрагментов ДНК, кодирующих антигенозначимые аминокислотные последовательности вирусов Марбург и Ласса. Для получения комплементарной ДНК (кДНК) вирусов Марбург и Ласса осуществляли постановку обратной транскрипции, составы реакционных смесей вкючали: для вируса Марбург - 10 мкл вирусной РНК, 20 пмоль праймера PrD1NC Marburg: 5' - CGCGAAGCTTATTGAGCACGAATCT - 3', 20 ед. ингибитора рибонуклеаз, 2 мкл 5х ОТ-буфера для обратной транскриптазы; для вируса Ласса - 10 мкл вирусной РНК, 20 пмоль праймера LVJ_F: 5' -AAGCTTGAAGAGCTCTCCTGAAT - 3', 20 ед. ингибитора рибонуклеаз, 2 мкл 5х ОТ-буфера для обратной транскриптазы. Реакционные смеси инкубировали 5 мин при 90 оС с последующим охлаждением до 42оС, далее вносили по 1 мкл смеси дезоксинуклеотидтрифосфа-тов (дНТФ), содержащей по 10 мM дАТФ, дЦТФ, дГТФ и дТТФ, по 2 мкл 5х ОТ-буфера для обратной транскриптазы, по 100 ед. обратной транскриптазы и деионизированную воду до конечных объемов 20 мкл, после чего смеси инкубировали еще 1 ч при 42оС. Для амплификации фрагмента ДНК, кодирующего антигенозначимую аминокислотную последовательность вируса Марбург, к 10 мкл соответствующей кДНК добавляли 15 пмоль праймера PrD1NC Mar burg, 15 пмоль праймера PrR1NC Marburg: 5' - GCGCG-GATCCTCCTGGTTGGTCGAT - 3', 10 мМ каждого дНТФ, 2,5 ед. Taq-полимеразы, деионизированную воду до конечного объема 50 мкл. Режим амплификации: 94оС -- 2 мин; 94оС -- 15 с, 50оС--45 с, 72оС -- 45 с, количество циклов -- 30. Для амплификации фрагмента ДНК, кодирующего антигенозначимую аминокислотную последовательность вируса Ласса, к 10 мкл соответствующей кДНК добавляли 25 пмоль праймера LVJ_F, 25 пмоль праймера LVJ_R: 5' - GGATCCGAACGACTCTAGGTGTC - 3 ', 10 мМ каждого дНТФ, 2,5 ед. Taq-полимеразы, деионизированную воду до конечного объема 50 мкл. Режим амплификации: 94оС - 2 мин; 94оС - 15 с, 55оС - 45 с, 72оС - 45 с, количество циклов - 30. Анализ фрагментов ДНК, синтезированных в ПЦР, проводили с помощью электрофореза в 1,5% агарозном геле. Продукты рестрикционного анализа гибридных плазмид анализировали в 0,9% агарозном геле. Электрофорез вели при напряжении тока 10 В/см геля в трис-ацетатном буфере, рН 8,0, в течение 25-35 мин. Визуализацию ДНК осуществляли посредством окрашивания геля бромистым этидием с последующим просмотром в УФ. Лигирование фрагментов ДНК выполняли в объеме 20 мкл при 22°С в течение 1 ч. В качестве лигирующего фермента использовали T4 DNA Ligase с концентрацией 5 ед/ мкл («Fermentas”, Литва). Подготовку и трансформацию плазмидной ДНК компетентной клеточной культуры проводили по методике, описанной ранее [1]. Выделение плазмидной ДНК. Выделение плазмидной ДНК осуществляли с использованием набора реагентов QIAprep Spin Miniprep Kit (“Qiagen”) согласно прилагаемой инструкции. Аффинная металлохелатная хроматография. Постановку металлохелатной хроматографии осуществляли по методике, описанной ранее [1]. Электрофоретический анализ полученных рекомбинантных полипептидов в полиакриламидном геле проводили по общепринятой методике [4]. Для иммуноферментного анализа полученные рекомбинантные полипептиды сорбировали в лунки 96-луночных панелей в концентрации 0,1 мкг на лунку. Сорбцию проводили в объеме 100 мкл при 4°С в течение 18 ч в фосфатносолевом буферном растворе (ФСБ), рН 7,4. После удаления несвязавшегося антигена вносили по 100 мкл на лунку референс-сыворотки К+ и К- и сыворотки крови больных в разведении 1:100. Все разведения сывороток и конъюгата проводили на ФСБ с 0,05% твина-20 (ФСБ-Т). Сыворотки инкубировали при 37°С в течение 1 ч. В качестве конъюгата использовали антитела, диагностические к иммуноглобулину G, меченные пероксидазой хрена (“Sigma”, США), в разведении 1:2000. Инкубацию с конъюгатом проводили в течение 1 ч при 37°С. После каждого этапа панели промывали 5 раз ФСБ-Т. После отмывки панелей связанную пероксидазу выявляли внесением в лунки 100 мкл субстратного буфера. Реакцию останавливали внесением в лунки 50 мкл 0,9 М раствора серной кислоты. Результаты оценивали на ELISA-процессоре по уровню поглощения при длине волны 492 нм. Результаты и обсуждение Для получения фрагментов ДНК, кодирующих антигенозначимые аминокислотные последовательности вирусов Марбург и Ласса, были искусственно синтезированы 2 пары олигонуклеотидных последовательностей, включающие сайты специфических рестриктаз для последующего клонирования в экспрессирующий вектор. В результате постановки обратной транскрипции на соответствующих 42 матрицах и последующей ПЦР были получены необходимые фрагменты ДНК, специфичность которых была подтверждена методом рестрикционного анализа (рис. 1) и последующего прямого секвенирования. Таким образом, фрагмент ДНК размером 1306 пар нуклеотидных оснований (п.о.) для вируса Ласса, соответствующий 6/8 аминокислотной последовательности нуклеокапсидного белка, является специфичным, о чем свидетельствуют фрагменты его рестрикции размерами 194, 238 и 874 п.о., получаемые при обработке рестрик-тазой Bfu I, и что согласуется с данными теоретических расчетов (см. рис. 1, а). Фрагмент ДНК размером 341 п.о., полученный на матрице вируса Марбург и кодирующий антигенозначимый участок с 442-го по 549-й аминокислотный остаток (а.о.) транслируемой последовательности нуклеокапсидного белка, также является специфичным, что подтверждается получением ДНК-фрагментов 90 п.о. и 251 п.о. при его обработке рестрикционной эндонуклеа зой EcoR V (см. рис. 1, б). Далее полученные специфичные фрагменты ДНК вирусов Марбург и Ласса были очищены, обработаны рестриктазами BamH I и Hind III и лигирова-ны в полилинкер экспрессирующего вектора pJC40, широко используемого для транскрипции генов в бактериальных клетках под контролем Т7-промотора. Особенностью данного вектора является наличие дополнительного ДНК-фрагмента, кодирующего 10 остатков гистидина, которые при трансляции локализуются в N-концевой части рекомбинантного полипептида, что позволяет очистить получаемые рекомбинантные полипептиды с помощью аффинной металлохелатной хроматографии [2]. Полученными в реакции лигирования смесями были трансформированы компетентные клетки Exoli, штамм DH5a. Трансформанты выращивали на питательной среде, содержащей ампициллин в концентрации 50 мкг/мл. В результате селекции клонов и последующего выделения ДНК были получены 2 гибридные плазмиды: pJC40/6/8 NP Lassa, кодирующая антигенозначимый фрагмент 6/8 нуклеокапсидного белка вируса Ласса, и pJC40 NP Marburg, кодирующая антигенозначимый участок нуклеокапсидного белка вируса Марбург с 442-го по 549-й а.о. Рестрикционный анализ полученных рекомбинантных плазмид представлен на рис. 2. Из рисунка видно, что полученные рекомбинантные плазмиды pJc4o/6/8 NP Lassa (3, а) и pJc40 NP Marburg (3, б) содержат специфические вставки клонированных фрагментов, кодирующие антигенозначимые аминокислотные последовательности нуклеокапсидных белков вирусов Ласса и Марбург. Для экспрессии рекомбинантных полипептидов вирусов Ласса и Марбург осуществляли трансформацию компетентных пер-миссивных клеток Е.соИ, штамм BL21(DE3), гибридными плазмидами pJC40/6/8 NP Lassa и pJC40 NP Marburg. Клетки инкубировали на жидкой селективной среде LB до момента достижения бактериальной культурой оптической плотности OD600=0,3, после чего проводили индукцию синтеза рекомбинантных полипептидов внесением в среду культивирования изопропилтиогалакто-пиранозида в конечной концентрации 0,4 мМ [2]. Очистку рекомбинантных полипептидов от клеточных белков осуществляли методом аффинной ме-таллохелатной хроматографии с использованием HisBind колонки с иммобилизованными катионами Ni2+. Степень очистки полученных полипептидов от бактериальных белков оценивали методом электрофореза в полиакриламидном геле. На рис. 3 представлены результа- 874 п.о. — 238 п.о. 194 п.о. — 1 2 3 1 2 3 m Ilf ш — — 1306 п.о. 34*1 п о _ тт — *** _— — -251 п.о. — 90 п.о. Рис. 1. Электрофореграмма амплифицированных фрагментов ДНК вирусов Ласса и Марбург, оценка их специфичности. Дорожки: а: 1 — продукты рестрикции после обработки фрагмента, кодирующего антигенозначимый участок нуклеокапсидного белка вируса Ласса, рестриктазой Bfu I; 2 — ДНК-маркер GeneRuler lkb DNA ladder ("Fermentas"); 3 — фрагмент ДНК, кодирующий антигенозначимый участок нуклеокапсидного белка вируса Ласса; б: 1 —фрагмент ДНК, кодирующий антигенозначимый участок нуклеокапсидного белка вируса Марбург; 2 — ДНК-маркер 100bp Ladder ("Axygen"); 3 — продукты рестрикции после обработки фрагмента, кодирующего антигенозначимый участок нуклеокапсидного белка вируса Марбург, рестриктазой EcoR V. б 2322 п.о. — т --• -. — —3708 п.о. . -- - - -2402 п.о. «ИМ» ■ - - —1306 п.о. 500 п.о.— Пая* 4M»т*шф 100 п.о.— —2402 п.о. —331 п.о. Рис. 2. Рестрикционный анализ рекомбинантных плазмид pJC40/6/8 NP Lassa и pJC40 NP Marburg. Дорожки: а: 1 — Lambda DNA/HindIII Marker ("Fermentas"); 2 — линейная форма рекомбинантной плазмиды pJC40/6/8 NP Lassa; 3 — фрагменты рестрикции, полученные в результате обработки плазмидной ДНК pJC40/6/8 NP Lassa рестриктазами BamH I и Hind III; б: 1 — ДНК-маркер 100bp Ladder ("Axygen"); 2 — фрагменты рестрикции, полученные в результате обработки плазмидной ДНК pJC40 NP Marburg рестриктазами BamH I и Hind III. 43 48 кДа — 1 2 3 a 4 5 6 7 8 б 1 2 3 4 5 6 7 — -• — 60 кДа "W mm тт. Ä- _ _ —40 кДа , тт 24 кДа — тт —30 кДа -20 кДа Рис. 3. Электрофоретический анализ рекомбинантных полипептидов вирусов Ласса и Марбург, очищенных методом аффинной металлохелатной хроматографии. Дорожки: а: 1 — лизат клеток, содержащий рекомбинантный полипептид вируса Ласса; 2 — лизат бактериальных клеток после обработки ультразвуком и центрифугирования; 3 — лизат клеток после нанесения на колонку; 4, 5 — фракции отмывки; 6, 8 — фракции элюции; 7 — маркер молекулярных масс ("Fermentas"); б: 1 — лизат бактериальных клеток, содержащий рекомбинантный полипептид вируса Марбург, после обработки ультразвуком и центрифугирования; 2 — лизат клеток после нанесения на колонку; 3, 4 — фракции отмывки; 5, 6 — фракции элюции; 7 — маркер молекулярных масс ("Fermentas"). Оценка антигенной специфичности рекомбинантных полипептидов вирусов Ласса и Марбург Сыворотка крови, содержащая антитела к вирусу Показатель оптической плотности рекомбинантный антиген вируса Ласса рекомбинантный антиген вируса Марбург Марбург 0,134 ± 0,015 1,101 ± 0,0165 Ласса 1,018 ± 0,004 0,137 ± 0,0075 ККГЛ 0,173 ± 0,0065 0,154 ± 0,009 ГЛПС 0,162 ± 0,034 0,158 ± 0,011 Денге 0,119 ± 0,0015 0,12 ± 0,007 Контроль 0,049 ± 0,0015 0,074 ± 0,016 конъюгата K- 0,15 ± 0,0105 0,175 ± 0,024 ты электрофоретического анализа очищенных рекомбинантных полипептидов. Из рисунка видно, что в результате хроматографии во фракциях элюции, дорожки 6, 8 (а), освобождается полипептид с молекулярной массой 48 кДа, соответствующей теоретически рассчитанной, включающий 6/8 аминокислотной последовательности нуклеокап-сидного белка вируса Ласса, а также рекомбинантный полипептид вируса Марбург с молекулярной массой 24 кДа, дорожки 5, 6 (б), включающий антигенозначимый участок нуклеокапсидного белка с 442-го по 549-й а.о. Для оценки антигенной активности, а также возможности полученных рекомбинантных полипептидов перекрестно реагировать с антителами к другим возбудителям особо опасных геморрагических лихорадок осуществляли постановку ИФА с сыворотками, содержащими антитела к вирусам лихорадки денге, ККГЛ, ГЛПС, лихорадки Лас-са, лихорадки Марбург. Результаты исследования представлены в таблице. Из таблицы видно, что оба рекомбинантных полипептида способны связывать соответствующие специфические антитела, присутствующие в сыворотках крови, о чем свидетельствуют полученные показатели оптической плотности 1,018 ± 0,004 (для рекомбинантного полипептида вируса Ласса) и 1,101 ± 0,0165 (для рекомбинантного полипептида вируса Марбург). Таким образом, в результате исследований получены векторные конструкции pJC40/6/8 NP Lassa и pJC40 NP Marburg, позволяющие экспрессировать рекомбинантные полипептиды вирусов Ласса и Марбург в прокариотических клетках Exoli, штамм BL21(DE3). Полученные рекомбинантные полипептиды способны связывать соответствующие специфические антитела, ч