Сравнительная оценка иммуноферментных тест-систем для определения антител класса G к вирусу эпидемического паротита

Полный текст

Известно, что высокий уровень вакцинации населения и даже серопозитивности вакцинированных в принципе не исключает трансмиссию вируса паротита (ВП) в популяции и развитие вспышек паротитно-вирусной инфекции [4, 6, 18]. Очевидно, что определение только уровня серопозитивности вакцинированной популяции на данном этапе является недостаточным критерием для оценки протективности вакцинации. Самым распространенным методом оценки иммунного ответа организма на ВП является определение уровня специфических антител (IgG) в сыворотке крови посредством иммуноферментного анализа (ИФА). Общепризнано, что ИФА-тест-системы, являясь более простыми, быстрыми и удобными в применении, в то же время менее специфичны, чем метод нейтрализации [5, 6, 8, 9, 18]. Использование в популяционных исследованиях разных ИФА-тест-систем, которые обладают разной чувствительностью и специфич ностью, приводит к некоторому искажению реального уровня популяционного иммунитета [3, 7, 17]. Результаты исследований иммунитета против ВП могут также различаться в зависимости от генотипа ВП, который используется в исследовании, а также от типа определяемых специфических IgG [3, 11, 14, 17]. ИФА-тест-системы позволяют измерить общий уровень специфических IgG, из которых лишь часть является функционально значимой и определяется в реакции нейтрализации (РН). Метод нейтрализации общепризнан как «золотой стандарт», будучи наиболее специфичным, чувствительным и точным, в то же время он является достаточно трудоемким и затратным по времени и ресурсам [5, 6, 9, 15]. Отсутствие стандартизации лабораторных исследований прежде всего в связи с тем, что нет международного стандарта, противопаротитной сыворотки, является существенной проблемой при оценке уров Контактная информация: Отрашевская Елена Викторовна, нач. отд.; e-mail: e.v.otrashevskaya@microgen.ru 38 ня поствакцинального популяционного иммунитета [18], а также при определении минимальных протек-тивных титров противопаротитных IgG [14-16]. Мы провели изучение сывороток здоровых добровольцев на наличие специфических IgG к ВП с помощью двух коммерческих ИФА-тест-систем (российской и зарубежной), а также методом нейтрализации с 4 штаммами ВП - вакцинным штаммом Ленинград-3 (Л-3) и 3 “дикими” штаммами разных генотипов. Материалы и методы Для участия в исследовании было отобрано 70 здоровых (без хронических заболеваний) мужчин в возрасте 20-25 лет без учета факта вакцинации против паротита и наличия паротитной инфекции в анамнезе. Все добровольцы дали письменное согласие на участие в исследовании. Специфические IgG в сыворотке определяли одновременно в наборах “Enzygnost Anti-Parotitis Virus ELISA/IgG” компании “Dade Behring Inc.” (Германия) и “Паротит-скрин” ЗАО БК “Биосервис” (Россия) согласно инструкциям производителей. Данные тест-системы были выбраны потому, что система “Паротит-скрин” наиболее часто используется для популяционных исследований в России [1], а “En-zygnost” использовалась в качестве референс-системы при проведении широкомасштабных исследований (в 21 стране) по стандартизации серологических методов [17]. Результаты оценивали качественно как положительный или отрицательный. Сыворотки с неоднозначными результатами исследовали повторно. Реакцию нейтрализации проводили с вакцинным штаммом Л-3 (GenGank JF 727651-JF727652) - РН 1 и штаммом Enders (генотип A) - РН 2. По данным производителей, именно эти штаммы ВП используются в ИФА-тест-системах “Enzygnost” и “Паротит-Скрин”. В исследовании также применяли дикие штаммы ВП - Drag94 (генотип C, GenBank AY669145) и Petron-Nov (генотип H, GenBank AY681495), изолированные ранее на территории РФ [4]. РН выполняли по ранее описанной методике [4-6]. Отрицательный контроль (охарактеризованная неиммунная сыворотка) использовали в каждой РН. Титр 1:4 был принят как минимальный уровень серопозитивности в РН [5]. Каждый образец сыворотки исследовали трехкратно каждым методом. Статистическую достоверность определяли как p < 0,05. Для проверки взаимосвязи между показателями рассчитывали ранговый коэффициент корреляции Спирмена (r), критерии Ньюмена-Кейлса и МакНимара [13]. Таблица 1 Результаты качественного анализа сывороток здоровых добровольцев на наличие специфических IgG к ВП методами ИФА и РН Метод исследования Штамм ВП Положительный результат Отрицательный результат ИФА-1 Enders, генотип A 37 (52,9%) 33 (47,1%) ИФА-2 Ленинград-3 56 (80,0%)* 14 (20,0%)* РН-1 Enders, генотип A 38 (54,3%) 32 (45,7%) РН-2 Ленинград-3 46 (65,7%) 24 (34,3%) РН-3 PetroNov, генотип H 26 (37,1%) 44 (62,9%) РН-4 Drag94, генотип C 31 (44,3%) 39 (55,7%) Примечание. * - p < 0,05. ных результатов в РН-2 среди 4 РН объясняется вакцинацией большинства добровольцев в детстве российской вакциной, содержащей штамм ВП Л-3. Результаты попарного сравнения данных, полученных при тестировании сывороток методами ИФА и РН, представлены в табл. 2. При оценке частоты совпадений результатов выявлен самый высокий процент совпадений (98,6) и самый высокий коэффициент корреляции (r = 0,9) между ИФА-1 и РН-1. Этот результат объясняется тем, что в ИФА-1 и РН-1 в качестве антигена использовали штамм ВП Enders. На этом фоне неожиданным оказался результат совпадений (77,1%) и коэффициент корреляции (r = 0,6) между ИФА-2 и РН-2, несмотря на то что в качестве антигена в обеих исследованиях использовали штамм ВП Л-3. Высокий процент совпадений результатов (82,9) и высокий коэффициент корреляции (r > 0,7) между РН-1 и РН-2 в нашем исследовании был достаточно ожидаемым, так как ранее была отмечена высокая корреляция и минимальная разница между титрами нейтрализующих антител к штаммам Л-3 и Enders у привитых российской паротитной вакциной добровольцев [2, 4]. При попарном межгрупповом сравнении результатов с использованием критериев Ньюмена-Кейлса и МакНимара получено статистическое подтверждение достоверности совпадения результатов ИФА-1 и РН-1, а также РН-1 и РН-2 (p > 0,05) и различия между результатами, полученными в ИФА-1 и ИФА-2 (p < 0,005), а также в ИФА-2 и РН-2 (p < 0,022). При сравнении результатов тестирования сывороток здоровых добровольцев на наличие специфических IgG к штаммам Л-3 и Enders с результатами РН-3 и Результаты Результаты исследования сывороток 70 здоровых добровольцев на наличие специфических IgG к ВП представлены в табл. 1. Результаты тестирования сывороток с помощью ИФА-тест-системы “Паротит-скрин” (ИФА-2) достоверно (p < 0,05) отличались от результатов, полученных при тестировании с помощью тест-системы “Enzygnost” (ИФА-1), а также от результатов РН-2 (p < 0,05). Результаты исследований в ИФА-1 и РН-1 были статистически сопоставимы (p > 0,05). Самый высокий процент положитель- Таблица 2 Результаты сравнения данных тестирования сывороток здоровых добровольцев на наличие специфических IgG к ВП методами ИФА и РН и индекс корреляции (r) результатов Метод исследования Совпадение положительных результатов Совпадение отрицательных результатов Общее количество совпадений r p ИФА-1/РН-1 35 (50%) 34 (48,6%) 69 (98,6%) 0,9 < 0,001 ИФА-2/РН-2 42 (60,0%) 12 (17,1%) 54 (77,1%) 0,6 < 0,001 ИФА-1/ИФА-2 35 (50,0%) 16 (22,9%) 51 (72,9%) 0,5 < 0,001 РН-1/РН-2 34 (48,6%) 24 (34,3%) 58 (82,9%) 0,7 < 0,001 ИФА-1/РН-2 34 (48,6%) 24 (34,3%) 58 (82,9%) 0,7 < 0,001 ИФА-2/РН-1 36 (51,4%) 16 (22,9%) 52 (74,3%) 0,5 < 0,001 39 РН-4 (табл. 3) выявлено практически одинаковое количество совпадений положительных результатов. Самый низкий процент совпадений отрицательных результатов имела ИФА-2. Таким образом, в ИФА-2 вновь было получено самое большое количество положительных результатов. Опосредованно еще раз подтверждена разница между ИФА-2 и РН-2 относительно результатов РН-3 и РН-4. При этом общее количество совпадений результатов ИФА-1 и РН-1 с результатами РН-3 и РН-4 практически одинаково (см. табл. 3). Следует отметить, что воспроизводимость результатов в обеих ИФА-тест-системах (троекратное исследование всех сывороток) была практически одинаковой - 94% для ИФА-2 и 96% для ИФА-1. Обсуждение При проведении «слепого» исследования сывороток 70 здоровых добровольцев на наличие специфических антител к ВП тест-система «Паротит-Скрин» дала значительно больше положительных результатов, чем «Enzygnost”. При этом корреляция результатов между ИФА-методом и методом нейтрализации в паре “Паротит-скрин”/РН с ВП Л-3 (r = 0,6) была значительно ниже, чем в паре “Enzygnost”/ РН с ВП Enders (r > 0,9). Учитывая более высокую специфичность и чувствительность РН [5, 6, 9, 15] в сравнении с ИФА, можно сделать заключение об относительно высокой специфичности ИФА-тест-системы “Enzygnost” (98,6%) и относительно низкой специфичности “Паротит-скрин” (77,1%). В нашем исследовании использовались гомологичные штаммы ВП в ИФА и РН, поэтому его можно оценить как релевантное. При проведении популяционных серологических исследований всегда возникает вопрос, насколько серопозитивный статус вакцинированных коррелирует с уровнем защиты от ВП. По мнению некоторых исследователей, серологическое исследование специфических IgG в ИФА-тест-системах с большой степенью вероятности дает завышенную оценку протективности многих вакцин против ВП [10]. Проблемы лабораторной оценки протективно-сти поствакцинального иммунитета периодически обсуждаются [3, 4, 14]. Прежде всего отмечается недостаточная корреляция между используемыми ИФА-тест-системами и “золотым стандартом” РН, что особенно влияет на информативность исследований популяционного иммунитета против ВП [4, 7, 14, 17]. Следует отметить, что на данном этапе сам “золотой стандарт” РН не имеет стандартного протокола [2, 4-6, 15, 18]. Также нет международных стандартных противопаротитных референс-сывороток. Широкомасштабные серологические исследования по кори, паротиту и краснухе, проведенные в 21 стране с использованием 16 разных ИФА-тест-систем, показали, что именно для ВП характерно наличие ложноположительных результатов [17]. Данный факт частично объясняется кросс Таблица 3 Результаты сравнительного тестирования сывороток здоровых добровольцев на наличие специфических IgG к ВП методом РН со штаммами ВП генотипов C и H Метод ис- Совпадение положительных результатов Совпадение отрицательных результатов Общее количество совпадений РН-3 РН-4 РН-3 РН-4 РН-3 РН-4 ИФА-1 27 (38,6%) 23 (32%) 31 (44,3%) 30 (42,9%) 58 (82,9%) 53 (75,7%) ИФА-2 28 (40,0%) 24 (34,3%) 15 (21,4%) 16 (22,9%) 43 (61,4%) 40 (57,1%) РН-1 28 (40,0%) 23 (32,9%) 30 (42,9%) 31 (44,3%) 58 (82,9%) 54 (77,1%) РН-2 28 (40,0%) 24 (34,3%) 25 (35,7%) 24 (34,3%) 53 (75,7%) 48 (68,6%) реактивностью между ВП и другими парамиксови-русами в системе ИФА, в частности вирусом парагриппа [17]. На результат исследований также влияет штамм ВП, используемый в ИФА-тест-системе. Было отмечено, что применение гетерологичных штаммов ВП ставит под сомнение релевантность сравнительных исследований сывороток методами ИФА и РН [12, 14, 17]. Функционально значимыми являются только антитела, обладающие нейтрализующей активностью [4-6, 14, 15, 17]. Ранее были показаны отсутствие корреляции между серологическими титрами специфических IgG и титрами нейтрализующих IgG [2], а также возможность отсутствия нейтрализующих антител при наличии высоких серологических титров противопаротитных IgG [3, 5, 6, 13]. Данный феномен в значительной степени объясняется использованием разных (гетерологичных) штаммов ВП в ИФА и РН [2, 4-6, 12, 14, 15, 17]. По нашему мнению, для серологической оценки иммуногенности вакцины ИФА-тест-система, должна содержать в качестве антигена штамм ВП, идентичный вакцинному штамму. ИФА-тест-система должна быть также откалибрована относительно “золотого стандарта” - РН с тем же штаммом ВП. Первое условие было соблюдено в ИФА-тест-системе “Паротит-скрин”, в которой используется штамм ВП Л-3. Калибровка относительно РН с гомологичным штаммом ВП, судя по корреляции и количеству совпадений результатов в наших исследованиях, не была выполнена для ИФА-тест-системы “Паротит-скрин”. В заключение необходимо отметить следующее. Чтобы по титрам специфических IgG можно было судить о протективности иммунитета, необходимо не только использовать ИФА-тест-систему. произведенную на основе вакцинного или гомологичного ему штамма ВП и коррелирующую с показателями РН с тем же штаммом ВП, но и знать спектр нейтрализующей активности и уровень кросс-реактивности специфических поствакцинальных IgG [2, 16] относительно циркулирующих “диких” штаммов ВП. Такое исследование ранее было проведено для российского вакцинного штамма Л-3 [2] и частично для штамма Jeryl Lynn [16]. Создание стандарта противопаротитной сыворотки, стандартизация протокола РН и калибровка ИФА-тест-систем относительно стандартной РН с вакцинным штаммом ВП сделают все популяционные исследования сопоставимыми, а оценку эффективности вакцинации против паротита более

Список литературы

Дополнительные файлы