Генетические особенности вируса Пуумала (Hantaviridae: Orthohantavirus), обнаруженного в Московской области

Полный текст

Введение

Представители рода Orthohantavirus являются одними из важнейших вирусных зоонозов. Они были обнаружены на всех континентах, кроме Антарктиды. В большинстве случаев каждый вид хантавируса ассоциирован с одним видом мелких млекопитающих, являющихся их природным резервуаром [1]. Патогенные для человека хантавирусы переносятся грызунами [2], в популяциях которых они циркулируют в виде бессимптомной инфекции. Заражение происходит при вдыхании пылевых аэрозолей, образующихся из выделений зараженных животных, а также при укусах [3]. У человека они могут вызвать геморрагическую лихорадку с почечным синдромом (ГЛПС) либо хантавирусный пульмональный синдром (ХПС) [2, 4].

В России обнаружены несколько патогенных хантавирусов: вирусы Пуумала, Хантаан, Сеул и Добрава-Белград (варианты Куркино и Сочи) [5]. Наиболее важным возбудителем является вирус Пуумала, на его долю приходится до 98% от всей заболеваемости ГЛПС в России [5]. Он вызывает ГЛПС с низкой летальностью (менее 1%), в Европе более известную как эпидемическая нефропатия. Природным резервуаром вируса Пуумала является рыжая полевка Myodes glareolus [6].

Жизнедеятельность популяций грызунов-носителей хантавирусов зависит от климатических условий, влияющих на урожай семян и возможность подснежного размножения, в связи с чем заболеваемость ГЛПС варьируется год от года [7]. Максимальная численность популяции рыжей полевки приходится на широколиственные и хвойно-широколиственные смешанные леса, поэтому наиболее эпидемиологически активные очаги ГЛПС-Пуумала в России расположены на Урале и Среднем Поволжье [5, 7].

Вирионы вируса Пуумала покрыты оболочкой и содержат три геномных сегмента одноцепочечной РНК отрицательной полярности: малый (S), средний (M) и большой (L), их длина составляет приблизительно 1828, 3650 и 6550 нуклеотидов соответственно [8].

Вирус Пуумала разделяют на 8 генетических линий: Центральноевропейская (CE), Альпийско-Адриатическая (ALAD), Датская (DAN), Южно-Скандинавская (S-SCAN), Северо-Скандинавская (N-SCAN), Финская (FIN), Русская (RUS) и Латвийская (LAT) [9, 10]. Генетические линии RUS, FIN и LAT имеют общего предка и происходят из одной рефугии [10]. В России был обнаружен вирус Пуумала, относящийся к линиям RUS и FIN [11, 12], также на территории Курской области был найден вирус, относящийся к ветви, получившей название W-RUS [13].

Заболеваемость ГЛПС регистрируется в 52 регионах Европейской территории России [5]. При этом основная ее часть сконцентрирована в Приволжском федеральном округе (ПФО) [14–18]. На Центральный федеральный округ (ЦФО) приходится около 13% всей заболеваемости ГЛПС в России. Количество случаев ГЛПС в ЦФО, бо́льшая часть которых вызвана вирусом Пуумала, увеличилась примерно на 1/3 по сравнению с предыдущем десятилетием [19]. Несмотря на относительно высокие показатели заболеваемости, данные о нуклеотидных последовательностях хантавирусов, циркулирующих на этой территории, весьма скудны. В частности, нам не удалось найти в базе данных GenBank (NCBI) полных кодирующих последовательностей S-сегмента, изолированных на территории ЦФО, помимо результатов, полученных в нашем предыдущем исследовании [13]. В настоящей работе мы исследовали вирусы, которые были выделены от рыжих полевок, отловленных на территории Волоколамского района Московской области.

Материалы и методы

Сбор биологического материала

Отлов грызунов проводили в Волоколамском районе Московской области в 2019–2020 гг. с использованием ловушек Щипанова [20]. Сбор проводился в три этапа: 17–18.06.2019 было поймано 42 особи (окрестности с. Новопавловское, 55,935984° с.ш., 36,169937° в.д., 200 ловушко-суток), 18–19.09.2019 – 26 особей (окрестности с. Новопавловское, 90 ловушко-суток) и 28.07–04.08.2020 – 41 особь (окрестности с. Суворово, 56,127875° с.ш., 35,871444° в.д. и с. Алферьево, 450 ловушко-cуток). Видовую принадлежность мелких млекопитающих определяли морфологически. Затем животных умерщвляли и от них стерильно забирали участки тканей печени, селезенки, почек и легких. В настоящей работе следовали стандартным методам безопасного обращения и отбора проб от мелких млекопитающих, которые потенциально заражены инфекционными патогенами [21]. Авторы подтверждают соблюдение институциональных и национальных стандартов по использованию лабораторных животных в соответствии с Consensus author guidelines for animal use ( IAVES 23 July 2010). Протокол исследования одобрен Локальным этическим комитетом (Протокол № 92 от 20 мая 2019 г.).

Экстракция РНК

Экстракцию РНК проводили из 10% суспензии тканей легких, приготовленной на PBS-буфере, с использованием набора реагентов «РИБО-преп» (ФБУН ЦНИИ Эпидемиологии Роспотребнадзора, Москва) согласно инструкции производителя.

Амплификация и секвенирование

Для получения кДНК использовали набор «Реверта L» производства ФБУН ЦНИИ Эпидемиологии Роспотребнадзора согласно инструкции производителя. Далее все образцы были протестированы с помощью «вложенной» полимеразной цепной реакции (ПЦР) с использованием родоспецифичных праймеров, амплифицирующих участок L-сегмента [22]. Полученные ампликоны были секвенированы методом Сэнгера с внутренних праймеров «вложенной» ПЦР.

Для получения протяженных последовательностей трех сегментов с помощью праймеров, информация о которых опубликована ранее [13], были получены ампликоны размером около 1200 нуклеотидов с перекрывающимися областями около 500 нуклеотидов.

Полученные ампликоны для каждой из проб были смешаны в эквимолярном соотношении. Для получения индексированных библиотек использовали набор Nextera XT Library Prep Kit (Illumina, США) согласно инструкции производителя. Выделение фрагментов ДНК в диапазоне от 200 до 400 п.н. проводили с использованием магнитных частиц Agencourt AMPure XP (Beckman Coulter, США). Диапазон длин фрагментов оценивали с использованием набора Agilent High Sensitivity DNA Kit (Agilent Technologies, Германия) на биоанализаторе Agilent 2100. Измерение концентрации полученных библиотек проводили при помощи количественной ПЦР (NEBNext Library Quant Kit for Illumina, New England Biolabs, Великобритания). Нормализованные библиотеки секвенировали с помощью прибора MiSeq с использованием MiSeq Reagent Kit v3.

Сборка первичных данных

Для предварительной обработки fastq файлов использовали программы Trimmomatic v0.39 [23] и cutadapt v3.4 [24]. Выравнивание ридов на референсы проводили в программе bowtie2 v2.4.4 [25], в качестве референсов использовали последовательности вируса Пуумала NC_005224.1, NC_005223.1, NC_005225.1 для S, M и L-сегментов соответственно. Сборку консенсусов проводили последовательно 2 раза. Сначала – с помощью Lofreq v2.1.5 [26] и bcftools consensus v1.13 [27], после чего полученные консенсусы использовали повторно в качестве референсов в bowtie2. Вторую сборку консенсусов осуществляли с использованием GATK HaplotypeCaller v4.2.0.0 [28] и bcftools consensus.

Филогенетический анализ

Для построения филогенетических деревьев и расчета генетических дистанций использовали программу MEGA X [29]. Конструирование филогенетических деревьев проводили методом Maximum Likelihood с применением модели General Time Reversible (G+I). Полученные последовательности были дополнены другими последовательностями вируса Пуумала из базы данных GenBank.

Результаты

В ходе полевых работ было отловлено 109 грызунов (табл. 1). В сообществе мелких млекопитающих смешанного леса в отловах преобладали рыжие полевки M. glareolus, а на лугу и в кустарниковых зарослях вдоль ручья – малая лесная мышь (A. uralensis) и желтогорлая мышь (A. flavicollis).

 

Таблица 1. Результаты отлова грызунов и исследования образцов на наличие РНК хантавирусов

Table 1. Results of trapping of rodents and researching samples for the presence of hantaviral RNA

Локация Location	Биотоп Biotope	Ловушко-суток Trap-days	Количество ПЦР-положительных особей/пойманных особей PCR-positive specimens/Trapped specimens
			всего all	Myodes glareolus	Microtus oeconomus	Microtus sp.	Apodemus flavicollis	Apodemus uralensis	Apodemus agrarius
Новопавловское Novopavlovskoe	Смешанный лес Mixed forest	290	3/68	3/59	0/1	–	0/6	0/2	–
Суворово Suvorovo	Смешанный лес Mixed forest	200	2/21	2/16	–	–	0/2	0/2	0/1
Алферьево Alferevo	Луг, кустарники Meadow, shrubs	250	1/20	1/7	–	0/2	0/1	0/6	0/4
Всего All		740	6/109	6/82	0/1	0/2	0/9	0/10	0/5

Примечание. «–» – отсутствовали в отловах.

Note. «–» – were absent in the trapping.

 

В результате ПЦР-анализа среди отловленных животных в образцах M. glareolus было выявлено 6 образцов, содержащих РНК хантавирусов. Три положительные особи были отловлены вблизи села Новопавловское, две – рядом с Суворово, одна – в Алферьево. Доля инфицированных рыжих полевок составила 7,3%.

Положительные образцы были секвенированы с праймерами, фланкирующими фрагмент L-гена, длиной 347 п.н. В таблице 2 указаны идентификаторы полученных последовательностей в базе данных GenBank. Все последовательности относились к вирусу Пуумала.

 

Таблица 2. Данные о результатах секвенирования вируса Пуумала

Table 2. Data on the Puumala virus sequencing results

Зоологический номер ID	Место изоляции Isolation point	Название изолята Isolate name	Сегмент Segment	Длина, п.н. Length, bp	GenBank ID
45	Новопавловское Novopavlovskoye	Volokolamsk/Mg45	L	347	OQ503846
57	Новопавловское Novopavlovskoye	Volokolamsk/Mg57	L M S	5972 3058 1779	OQ606916 OQ606917 OQ606918
59	Новопавловское Novopavlovskoye	Volokolamsk/Mg59	L	347	OQ503847
79	Суворово Suvorovo	Volokolamsk/Mg79	L M S	6052 3543 1763	OQ606919 OQ606920 OQ606921
93	Суворово Suvorovo	Volokolamsk/Mg93	L	347	OQ503849
123	Алферьево Alferevo	Volokolamsk/Mg123	L	347	OQ503850

 

Для образцов № 57 и 79 из окрестностей с. Новопавловское и с. Суворово удалось получить протяженные последовательности всех сегментов (табл. 2). Для построения дендрограмм полученные последовательности были дополнены представителями вируса Пуумала, принадлежащими к генетической линии RUS. Представители других линий были взяты в качестве внешней группы. Филогенетические деревья были построены на основании выравниваний S-сегмента (рисунок а), M-сегмента (рисунок б) и L-сегмента (рисунок в). Для каждой последовательности указан регион изоляции и принадлежность к генетической линии.

 

Рисунок. Филогенетические деревья, построенные на основании выравниваний: а ‒ 1302 нуклеотидов S-сегмента, соответствующие полной рамке считывания белка нуклеокапсида; б ‒ 3050 нуклеотидов М-сегмента (частичная открытая рамка считывания, ОРС); в ‒ 5960 нуклеотидов L-сегмента (частичная ОРС). Последовательности, полученные в этом исследовании, выделены маркировкой. Конструирования филогенетических деревьев проводили методом Maximum Likelihood с применением модели General Time Reversible (G+I) с помощью программы MEGA X [29].

 

Филогенетические деревья демонстрируют, что генетические варианты из Волоколамского района по всем трем сегментам группируются с последовательностями из Курской области, представленными ранее как сублиния W-RUS [13].

Нуклеотидные различия между последовательностями из Волоколамского района составляют менее 4% для каждого из сегментов. А их различие с генетическими вариантами из Курской области составило менее 10%. В таблице 3 указаны генетические дистанции между полученными в этом исследовании последовательностями и генетическими вариантами вируса Пуумала из других локаций. Изолят AF284343 не был включен в расчет из-за недостаточной длины.

 

Таблица 3. Генетическая дистанция между нуклеотидными/аминокислотными последовательностями из Волоколамского района и последовательностями из других локаций (%)

Table 3. P-distance between nucleotide/amino acid sequences from Volokolamsk region and sequences from other locations (%)

Параметр	Волоколамский район Volokolamsk region
	S-сегмент, 1302 п.н. S segment, 1302 bp	М-сегмент, 3050 п.н. M segment, 3050 bp	L-сегмент, 5960 п.н. L segment, 5960 bp
Волоколамский район Volokolamsk region	3,31 0,69	3,49 1,19	3,26 0,45
Курскaя область Kursk region	8,3–9,38 1,15–1,62	9,04–9,54 1,28–1,58	9,47–9,66 1,41–1,61
Другиe представители генетической линии RUS Other RUS lineage representatives	10,91–13,91 1,62–3,93	12,69–13,94 1,87–3,46	13,01–14,14 1,06–1,56

Примечание. Расчет осуществляли по полной ОРС для S-сегмента и по частичным ОРС для M- и L-сегментов.

Note. The calculation was performed according to the complete ORF for the S segment, and partial ORF for the M and L segments.

 

Обсуждение

Согласно статистическим данным Роспотребнадзора, на территории ЦФО ежегодно наблюдается заболеваемость ГЛПС. Наибольшее количество случаев регистрируется в Ярославской, Рязанской, Костромской, а также Тульской областях. Бо́льшая часть случаев приходится на вирус Пуумала, еще 3–5% – на вирус Добрава-Белград [19]. Несмотря на это, генетические варианты, циркулирующие на территории ЦФО, крайне мало изучены: помимо последовательностей из Курской области, полученных в нашей предыдущей работе [13], на момент работы над статьей в базе данных GenBank имелось лишь две последовательности: AF284343 [30] и EU652421 [31].

Последовательность AF284343 была получена от рыжей полевки, отловленной на территории Егорьевского района Московской области во время вспышки ГЛПС-Пуумала в 1995 г. В соответствующей публикации изолят описан как новый генотип вируса Пуумала [30]. Это фрагмент S-сегмента длиной около 700 нуклеотидов, на дендрограмме (рисунок а) он кластеризуется с последовательностями из Курской области и Волоколамского района. Таким образом, по всей видимости, этот изолят также может быть отнесен к сублинии W-RUS.

EU652421 – это короткий (менее 300 нуклеотидов) фрагмент М-сегмента вирусной РНК, которая была выделена от рыжей полевки на территории Липецкой области. Его длина недостаточна для построения дендрограммы с надежной поддержкой, в связи с чем невозможно определить его принадлежность к сублинии W-RUS.

В настоящем исследовании была подтверждена циркуляция вируса Пуумала на территории Московской области [30]. Новые последовательности из Волоколамска кластеризуются с генетическими вариантами из Курской области, обозначенными ранее как ветвь W-RUS [30], по каждому из трех сегментов генома, что демонстрирует их принадлежность к этой же ветви и подтверждается тем, что генетические различия между последовательностями из Волоколамского района и Курской области меньше, чем таковые между последовательностями из Волоколамского района и другими представителями линии RUS (табл. 3).

Работы, посвященные систематизации разнообразия вируса Пуумала, базировались именно на последовательностях S-сегмента [11], по-видимому, из-за большей представленности в GenBank, а также из-за большей консервативности.

В статье Т. Sironen и соавт. (2001) [12] упоминается, что генетическая линия RUS состоит из двух сублиний, сформированных штаммами из Прибалтики и Европейской части России. В настоящем исследовании на филогенетическом дереве по S-сегменту генетическая линия RUS разделяется на три монофилетические группы. Третья ветвь, W-RUS, была описана в нашем предыдущем исследовании и дополнена в настоящей работе последовательностями из Волоколамского района.

Вариабельность внутри генетической линии RUS велика по сравнению с другими генетическими линиями [8]. В недавней работе были описаны систематизация и разделение наиболее представленной в GenBank части генетической линии RUS, относящейся к ПФО, на несколько сублиний [15]. Ветвь W-RUS является внешней группой по отношению ко всем описанным кладам вируса в ПФО, согласно филогенетическому исследованию, основанному на S- и L-сегментах (рисунок а, в).

Интересно, что топология ветвей в дендрограмме по М-сегменту значительно отличается от таковых по S- и L-сегментам. Это характерно для разных видов хантавирусов и обусловлено тем, что М-сегмент генома является наиболее вариабельным и наиболее часто участвует в реассортации [8, 9, 32, 33]. Это подтверждает вывод предыдущего исследования [13] о том, что обмен М-сегментами происходил и в эволюционной истории линии RUS.

Таким образом, представители ветви W-RUS были обнаружены в двух регионах: Курской и Московской областях. На основании этого можно предположить, что они также распространены на прилежащих территориях: в Орловской, Брянской, Калужской и Тульской областях. Для получения полной картины генетического разнообразия вируса Пуумала, циркулирующего на территории Европейской части России, необходимы дополнительные исследования с расширением не только географии работ, но и объемов выборки полевого и клинического материала для оценки всего генетического пейзажа вируса Пуумала, встречающегося на данной территории.

Заключение

На территории Волоколамского района Московской области в грызунах обнаружена РНК вируса Пуумула сублинии W-RUS.

Об авторах

Екатерина Алексеевна Блинова

ФБУН ЦНИИ Эпидемиологии Роспотребнадзора; ФГАНУ «ФНЦИРИП им. М.П. Чумакова РАН» (Институт полиомиелита)

Автор, ответственный за переписку.
Email: blinova.e@cmd.su
ORCID iD: 0000-0002-0735-5627

без степени, м.н.с.; 3а. аспирант

Россия, 111123, г. Москва; 108819, г. Москва

Марат Темирханович Макенов

ФБУН ЦНИИ Эпидемиологии Роспотребнадзора

Email: makenov@cmd.su
ORCID iD: 0000-0002-6835-4572

К.б.н, с.н.с.

Россия, 111123, г. Москва

Евгений Сергеевич Морозкин

ФБУН ЦНИИ Эпидемиологии Роспотребнадзора

Email: morozkin@cmd.su
ORCID iD: 0000-0001-8407-2623

К.х.н., с.н.с.

Россия, 111123, г. Москва

Иван Сергеевич Холодилов

ФГАНУ «ФНЦИРИП им. М.П. Чумакова РАН» (Институт полиомиелита)

Email: ivan-kholodilov@bk.ru
ORCID iD: 0000-0002-3764-7081

К.б.н, с.н.с.

Россия, 108819, г. Москва

Марина Вадимовна Федорова

ФБУН ЦНИИ Эпидемиологии Роспотребнадзора

Email: culicidae@mail.ru
ORCID iD: 0000-0002-1232-1624

К.б.н., c.н.с.

Россия, 111123, г. Москва

Ольга Борисовна Журенкова

ФБУН ЦНИИ Эпидемиологии Роспотребнадзора

Email: Zhurenkova@cmd.su
ORCID iD: 0000-0003-1571-4826

без степени, м.н.с.

Россия, 111123, г. Москва

Герман Викторович Роев

ФБУН ЦНИИ Эпидемиологии Роспотребнадзора; Московский физико-технический институт (национальный исследовательский университет)

Email: roev@cmd.su
ORCID iD: 0000-0002-2353-5222

без степени, м.н.с.; 3а студент

Россия, 111123, г. Москва; 141701, г. Москва

Камиль Фаридович Хафизов

ФБУН ЦНИИ Эпидемиологии Роспотребнадзора

Email: khafizov@cmd.su
ORCID iD: 0000-0001-5524-0296

К.б.н., заведующий лаборатории

Россия, 111123, г. Москва

Людмила Станиславовна Карань

ФБУН ЦНИИ Эпидемиологии Роспотребнадзора

Email: karan@cmd.su
ORCID iD: 0000-0002-5927-460X

без степени, Руководитель группы

Россия, 111123, г. Москва

Список литературы

Дополнительные файлы