Экзосомы в жизненном цикле вирусов и патогенезе вирусных инфекций

Полный текст

Введение

Экзосомы впервые были идентифицированы в культуральной жидкости ретикулоцитов. В 1983 г. две группы исследователей практически одновременно сообщили, что трансферриновые рецепторы ретикулоцитов ассоциируются с внутриклеточными везикулами небольших размеров (около 50 нм) и затем «буквально выбрасываются» (literally jettisoned) из созревающих ретикулоцитов во внеклеточное пространство [1, 2]. C.V. Harding и соавт. [1, 3] показали, что интернализованный трансферрин в клетках локализуется на большом количестве маленьких частиц внутри органелл, которые авторы назвали мультивезикулярными эндосомами (multivesicular endosomes). Мультивезикулярные эндосомы сливаются с плазматической мембраной с последующим высвобожденим (экстернализацией) везикул, впоследствии названных экзосомами [4]. Было высказано предположение, что клетки могут использовать этот механизм в качестве общего способа высвобождения мембранных везикул. Это открытие вызвало огромный интерес исследователей, и с тех пор опубликованы сотни статей по экзосомам, создан специальный журнал – Journal of Extracellular Vesicles), сформированы специализированные общества: International Society for Extracellular Vesicles, The American Society for Exosomes and Microvesicles.

В обзоре кратко рассмотрены некоторые вопросы биогенеза и функций экзосом. Особое внимание уделено участию экзосом в вирусных инфекциях.

Характеристика экзосом

Экзосомы – внеклеточные везикулы (ВВ) с двуслойной мембраной диаметром 30–160 нм (в среднем около 100 нм), имеют эндосомное происхождение. К классическим маркерам экзосом относят CD63, CD81 и CD9, флотиллины, церамиды, TSG101 (tumor susceptibility gene 101) и Alix (apoptosis-linked gene 2 interacting protein X) [5, 6] (рис. 1). В экзосомах обнаружены липиды, белки, все известные виды РНК, метаболиты [7, 8]. После высвобождения с поверхности клетки экзосомы могут взаимодействовать с внеклеточным матриксом и (или) проникать в клетки-реципиенты [9]. Экзосомы высвобождаются из клеток различного происхождения, они обнаружены в различных биологических жидкостях: в плазме и сыворотке крови, моче, спинномозговой жидкости, грудном молоке, слюне, желудочном соке, семенной и фолликулярной жидкостях, в кале [7, 10, 11]. Эти везикулы характеризуются большой гетерогенностью по размерам и функциям [12]. Содержание (груз) экзосом различается и определяется клеточным происхождением, метаболическим статусом и окружающей средой клеток-доноров, поэтому различают многочисленные подгруппы экзосом [8]. Перенося различные биоактивные молекулы в клетки-реципиенты, экзосомы могут участвовать в регуляции транскрипции и трансляции; пролиферации, репродукции, развитии, клеточной дифференцировке, патологических процессах, в том числе в неоплазии [12, 13].

 

Рис. 1. Содержимое экзосом и биомаркеры. В верхней половине – основные маркеры экзосом, представленные мембранными белками – тераспанинами CD9, CD63, CD81 и флотиллинами; липидами – церамидами, а также компонентами клеточной системы ESCRT (Endosomal Sorting Complex Required for Transport): Alix (apoptosis-linked gene 2 interacting protein X) и TSG-101 – продукт Tumor Susceptibility Gene 101 (tsg101). В нижней половине – вирусные компоненты, которые захватываются экзосомами в заражённых клетках, – геномные ДНК или РНК, вирусные структурные и неструктурные белки и вирионы.

 

Одна из важнейших проблем изучения и применения экзосом состоит в необходимости усовершенствования методов разделения и очистки везикул. Вслед за ультрацентрифугированием, градиентным центрифугированием и ультрафильтрацией разработаны более совершенные методы и инструменты: чип ExoTIC [14], технология AF4 (asymmetric-flow field-flow fractionation) [15], метод двойной иммунофильтрации (dual-patterned immunofiltration – ExoDIF) [16]. Появились методы идентификации, оценки размеров и содержимого экзосом с использованием специальных методов микроскопии, проточной цитометрии [5]. Оценка частоты использования девяти различных методов выделения и очистки экзосом, выполненная в 2019 г., показала, что работы, в которых использовали иммуноаффинные методы, сортировку клеток по флуоресценции (FACS) и преципитацию на полимерах, составляли приблизительно 3–5%, центрифугирование в градиенте плотности – 25%, фильтрацию – 34%, ультрацентрифугирование – 58% и дифференциальное центрифугирование – 73% от общего количества всех проанализованных публикаций. Таким образом, дифференциальное центрифугирование остаётся наиболее используемым методом, однако отмечается, что в большинстве исследований использовалась комбинация этих методов [17]. Для надёжной классификации экзосом и стандартизации технологий их использования необходимо дальнейшее совершенствование методов идентификации и очистки экзосом. ВВ подразделяются на три основных типа в зависимости от места их происхождения, плотности, экспрессии маркеров и размера:

a) экзосомы (30–150 нм);

б) микровезикулы (100–1000 нм);

в) апоптотические тельца (500–5000 нм) [18].

При этом следует учитывать большой разброс при определении размеров везикул [19]. В 2018 г. эксперты Международного общества внеклеточных везикул (The International Society for Extracellular Vesicles) опубликовали рекомендации, согласно которым в тех случаях, когда биогенез и отличительные свойства использованных везикул подробно не изучены, а их размеры значительно варьируют, более корректно использовать термин «экстраклеточные везикулы», в русскоязычной литературе принято обозначение ВВ. Термин «экзосомы» соответствует малым ВВ с размерами, не превышающими 200 нм [20]. Однако степень очистки везикул во многих исследованиях не определялась, и популяции везикул могли содержать как экзосомы, так и микровезикулы. В связи с этим при изложении результатов в дальнейшем мы будем использовать терминологию, приведенную в оригинальных исследованиях.

Биогенез экзосом

После проникновения в клетку компонентов внешней среды путём эндоцитоза интернализованный материал доставляется в ранние эндосомы (РЭ) (рис. 2). Затем происходит созревание РЭ, что включает снижение рН внутри органеллы, накопление в мембране фосфатидилинозитол-3-фосфата (PI3P), а также привлечение ряда ферментов семейства рабаптинов (Rab) и их активацию. Это приводит к образованию поздних эндосом (ПЭ). ПЭ, так же как и РЭ, выполняют сортировку содержимого, а также сенсорную и сигнальную функции, реагируя на внутри- и внеклеточные ситуации [21]. Участки мембраны выгибаются внутрь эндосомы и отпочковываются, создавая множественные внутрипросветные (интралюминальные) везикулы (ИЛВ), которые образуют мультивезикулярные тельца (МВТ). Интернализованные материалы, инкорпорированные в ИЛВ, из МВТ направляются по одному из трёх возможных путей (рис. 2): первый – в рециклирующие эндосомы для переработки, затем к плазматической мембране или к комплексу Гольджи; второй – к лизосоме для слияния с лизосомой и деградации; третий – к плазматической мембране для слияния и высвобождения в окружающую среду в виде экзосом.

 

Рис. 2. Схема биогенеза экзосом и участие клеточных белков семейства Rab. Молекулы и микрочастицы, проникающие в клетку путём эндоцитоза, условно обозначены как зелёный треугольник и жёлтый кружок. Rab5 участвует в слиянии эндоцитированных везикул с образованием ранней эндосомы (РЭ); Rab5 и Rab4 – транспорт к поздней эндосоме (ПЭ); Rab1 регулирует транспорт от эндоплазматического ретикулума (ЭР) к комплексу Гольджи (КГ). Rab2 участвует в рециркуляции и ретроградном транспорте от КГ обратно к ЭР. Rab6 регулирует перемещения внутри КГ. Rab7 регулирует эндосомальный транспорт от ПЭ и мультивезикулярных телец (МВТ) к лизосоме. Rab4 и Rab11, а также Rab 9 и Rab 25 регулируют переработку содержимого в рециклирующих эндосомах (РЦЭ) и транспортировку к плазматической мембране (ПМ). Rab27a и Rab35 участвуют в стыковке МВТ с плазматической мембраной; Rab 11 и Rab35 – в высвобождении везикул. В секреции везикул участвуют также Rab5a и Rab9a, усиливая выход экзосом.

 

В биогенезе экзосом участвуют многочисленные клеточные белки [22]. Довольно подробно изучены белки Rab, принадлежащие семейству консервативных клеточных ГТФаз суперсемейства Ras, включающего более 60 членов, причём одна клетка может содержать более 40 различных белков Rab [23]. Участие отдельных белков Rab в разных стадиях биогенеза экзосом отражено на рис. 2. Важную роль в биогенезе экзосом также играют белки эндосомального сортировочного комплекса ESCRT (Endosomal Sorting Complex Required for Transport), включая ESCRT-0, -I, -II, -III и вспомогательные белки, в том числе Vps4 ATФaзы. ESCRT-0, -I и -II участвуют в селективной сортировке убиквитинированных молекул; комплекс ESCRT-III и Vps4 – в инвагинации мембран и формировании ИЛВ, составляющих МВТ [24].

Роль экзосом в вирусных инфекциях

Исследования показали, что в экзосомах могут находиться и передаваться клеткам-реципиентам нуклеиновые кислоты, белки и даже вирионы оболочечных вирусов (рис. 1). Для создания условий, способствующих размножению и распространению, вирусы используют различные стратегии, влияя на регуляторные механизмы клетки и организма, в том числе на биогенез экзосом. В следующих разделах обзора будут рассмотрены основные результаты, отражающие участие экзосом в четырёх широко распространённых и социально значимых вирусных инфекциях, возбудителями которых являются вирус иммунодефицита человека 1-го типа (ВИЧ-1), вирус гепатита В (ВГВ), вирус гепатита С (ВГС) и коронавирус SARS-CoV-2.

Экзосомы и инфекция ВИЧ-1

После заражения клеток ВИЧ-1 рекрутирует комплексы ESCRT-I, -II и -III, которые участвуют в процессах взаимодействия вируса с клеткой на разных стадиях жизненного цикла вируса [25]. Для сборки ВИЧ-1 привлекаются белки комплекса ESCRT-I – TSG101 и Alix. Эти же компоненты необходимы для высвобождения ВИЧ-1 из заражённой клетки [26, 27]. В процессе выхода из клетки участвует белок Gag ВИЧ-1, который накапливается и заякоревается на плазматической мембране. Изучение ключевого компонента ESCRT – TSG101 с использованием системы CRISPR/Cas9 в клетках человека, инфицированных ВИЧ-1, подтвердило колокализацию клеточного белка TSG101 с белком Gag ВИЧ-1 в местах сборки вируса. Подавление или повышение экспрессии гена TSG101 сильно влияет на выход новых вирионов из мембран заражённых клеток и на продукцию ВИЧ-1. Таким образом, взаимодействие TSG101 с Gag ВИЧ может служить потенциальной мишенью для противовирусной терапии [28–30]. Сборку вирусных частиц и секрецию экзосом также регулируют белки семейства Rab [31].

Роль экзосом в патогенезе ВИЧ-инфекции неоднозначна. Показано, что экзосомы из Т-клеток содержат большое количество молекул CD4⁺, которые конкурируют с клетками хозяина за связывание с белками ВИЧ-1, препятствуя таким образом распространению вируса. Противовирусное действие могут проявлять также экзосомы, выделяемые из семенной жидкости, грудного молока и других биологических жидкостей, подавляя репликацию ВИЧ-1 [32]. С другой стороны, экзосомы из клеток, инфицированных ВИЧ-1, способны индуцировать активацию CD4⁺-Т-лимфоцитов и репликацию вируса, в том числе в латентно инфицированных клетках, что может привести к мобилизации латентного резервуара ВИЧ в организме [33].

Экзосомы и вирус гепатита В

Несмотря на использование эффективной профилактической вакцины, гепатит В продолжает оставаться важной проблемой здравоохранения, поскольку современные методы терапии не могут вылечить хронические формы гепатита. Отчасти этому способствует отсутствие достаточно полного представления о путях сборки и высвобождения ВГВ. Считается, что вхождение ВГВ в клетку происходит посредством эндоцитоза, в интернализации ВГВ и транспортировке из РЭ в ПЭ участвуют Rab5 и Rab7 [34]. Интересно, что на поздних стадиях репликации ВГВ тот же Rab7 способствует транспортировке вирусных частиц в лизосомы для их деградации [35]. Помимо белков Rab, которые действуют как молекулярные переключатели в транспорте везикул при ВГВ инфекции, вирус использует комплексы белков ESCRT [36, 37]. Важно, что интактные вирионы ВГВ могут высвобождаться в виде экзосом и передаваться не только в чувствительные, но и в нечувствительные к заражению клетки [38]. Таким образом, для обеспечения собственной репликации и распространения ВГВ использует эндоцитарный путь с участием клеточных систем Rab и ESCRT.

Исследования продемонстрировали, что экзосомы могут играть определённую роль в диагностике и лечении гепатита В. У пациентов с активной репликацией ВГВ (HBeAg-положительных) обнаружены более высокие уровни некоторых микроРНК (miR) в ВВ плазмы крови по сравнению с HBeAg-отрицательными, и уровни этих miR коррелировали с уровнями ДНК ВГВ и поверхностного антигена вируса (HBsAg) [39]. Сравнительное изучение экзосом в крови здоровых волонтеров, носителей ВГВ и больных хроническим гепатитом В привело к выводу, что экзосомальные микроРНК могут служить биомаркерами для выявления разных стадий инфекции, вызванной ВГВ [40]. Отмечено, что тетраспанин CD63, ассоциированный с ИЛВ и экзосомами, колокализован со структурными белками ВГВ LHBs и core (HBc). Подавление экспрессии CD63 РНК-интерференцией показало, что тераспанин CD63 влияет на сборку ВГВ и его инфекционность [41]. Другие авторы выделяли экзосомы из культурального супернатанта гепатоцитов HepAD38, реплицирующих ВГВ (линия, аналогичная HepG2.2.15), и использовали их для обработки человеческих мононуклеарных клеток периферической крови (PBMC) [42]. Экзосомы проникали в моноциты, но не в лимфоциты, и это приводило к повышению экспрессии PD-L1 на поверхности моноцитов и снижению экспрессии CD69 – маркера активированных иммунных клеток. Соответственно, экзосомы, секретируемые клетками HepAD38, способны вызывать иммуносупрессию, истощение Т-клеток и потенциально могут способствовать прогрессированию ВГВ-инфекции. В то же время препараты, ингибирующие обратную транскриптазу BГВ (энтекавир, ламивудин и тенофовир), изменяют содержимое экзосом таким образом, что это может ослаблять иммуностимулирующий потенциал вируса [42]. Для более детальной оценки влияния экзосом на патогенез гепатита В необходимы дальнейшие исследования.

Экзосомы и вирус гепатита С

ВГС вызывает острую инфекцию, которая в большинстве случаев переходит в хронический гепатит (ХГС) и прогрессирует в фиброз, цирроз и гепатоклеточную карциному. ХГС определяется более чем у 50 млн людей, однако вакцины против гепатита С пока нет, а препараты прямого противовирусного действия недоступны для многих пациентов из-за высокой стоимости, не препятствуют повторному инфицированию и рецидивам гепатоклеточной карциномы на фоне терапии препаратами прямого противовирусного действия. Это означает, что для разработки новых средств и, главное, для понимания патогенеза инфекции необходимы более детальные знания жизненного цикла вируса и взаимодействия его с клеточными процессами. Изучение жизненного цикла ВГС показало, что он может высвобождаться из клетки в составе экзосом, пройдя эндосомальный путь [43, 44]. В прохождении этого пути участвуют две клеточные системы – ESCRT и комплекс белков семейства Rab [45–48]. Активное участие белков семейства Rab наводит на мысль о возможном получении ингибиторов, которые могут подавить или блокировать ВГС-инфекцию. Пока такие ингибиторы не получены, но поиск путей воздействия на Rab ГТФазы продолжается [49]. Белки оболочки и белок core ВГС обнаружили в ИЛВ в составе MBТ, это показало, что эти белки локализованы и в экзосомах, причём для высвобождения ВГС в экзосомах критичен компонент ESCRT-0 HRS (hepatocyte growth factor-regulated tyrosine kinase substrate) [50, 51]. Интересно, что HRS требуется также для секреции экзосом из дендритных клеток и представления антигена через экзосомы [52]. Авторы полагают, что более полное понимание взаимодействия ВГС с клеточными путями ESCRT поможет выбрать новые мишени для противовирусной терапии широкого спектра действия [53]. Обнаружение в экзосомах структурных и неструктурных белков и РНК ВГС позволяет рассматривать экзосомы как источник циркулирующих биомаркеров, связанных с патологическими процессами при гепатите С. Это особенно важно для диагностики хронических гепатитов, так как эффективность современных неинвазивных методов признаётся международными экспертами серьёзным препятствием для успешного лечения хронических заболеваний [54, 55].

Содержимое экзосом значительно варьирует в зависимости от природы клеток-доноров, физиологического состояния, изменения внутриклеточной активности, микроокружения. В связи с этим особый интерес представляют циркулирующие экзосомы, полученные только из клеток печени. К преимуществам экзосом по сравнению с циркулирующими белками и комплексами РНК можно отнести высокую стабильность в биологических жидкостях, которую обеспечивают двухслойные липидные мембраны. Важно отметить, что изменения в экзосомах могут быть обнаружены на более ранних стадиях, чем явное повреждение тканей или другие клинические и гистологические признаки, как это было установлено на модели неалкогольного стеатогепатита у мышей [56]. Диагностика гепатита С проводится серологическими и молекулярными методами, которые позволяют оценить вирусную нагрузку и иммунный статус пациента. Развитие диагностических подходов на основе экзосом может дополнить и улучшить оценку повреждения печени и выявить ранние маркеры повышенного риска развития гепатокарциномы неинвазивными методами. Одна из проблем использования экзосом как биомаркеров ХГС состоит в том, что из большого пула циркулирующих экзосом технически сложно вычленить экзосомы, образовавшиеся в клетках печени [57]. Преодоление этих трудностей откроет новые возможности в диагностике ХГС, в том числе применение жидкой биопсии.

Эксперименты показали, что очищенные экзосомы из ВГС-инфицированных клеток гепатомы человека Huh7.5.1 содержали полноразмерную вирусную РНК, белки и вирусные частицы и были способны передавать продуктивную инфекцию ВГС незаражённым гепатоцитам [58]. Кроме того, определили, что антитела от больных гепатитом С лишь частично нейтрализовали ВГС-инфекцию, переданную через экзосомы, по сравнению со свободным вирусом. Это свидетельствует о том, что передача ВГС с экзосомами потенциально может быть одним из механизмов ускользания от иммунного ответа при гепатите С [58]. Для ответа на вопрос, возможно ли распространение ВГС через экзосомы, анализировали, может ли вирус использовать экзосомы для независимой от рецепторов передачи ВГС гепатоцитам [59]. Показали, что в сыворотках крови всех пациентов, инфицированных ВГС и не ответивших на лечение (интерферон α-2b (ИФН) + рибавирин), а также некоторых лиц, не получавших лечение, присутствовали экзосомы, содержащие минус-цепь РНК ВГС, образующуюся в процессе репликации вирусной РНК. Определили, что РНК ВГС в экзосомах находилась в комплексе с белком argonaute-2 (Ago2), белком теплового шока 90 (HSP90) и микроРНК miR-122 (рис. 3). Полученные данные, по мнению авторов, доказывают возможность передачи ВГС через циркулирующие экзосомы и указывают на потенциальные терапевтические стратегии, основанные на подавлении передачи ВГС через экзосомы. Однако следует отметить, что факт обнаружения антисмысловой цепи может и не говорить о передаче вируса при участии экзосом, так как её передача в клетки не обеспечит трансляцию генома вируса и образования белков ВГС – компонентов репликационного комплекса. Интересно, что экзосомы могут оказывать и противоположный эффект. Так, экзосомы, содержащие РНК ВГС, были способны транспортировать вирусную РНК к дендритным клеткам (pDC), РНК ВГС действовала на TLR7, активировала pDC, стимулировала синтез и секрецию ИФН-α, что вызывало подавление репликации ВГС и распространения вируса [60, 61].

 

Рис. 3. Схематическое представление передачи вируса гепатита С через экзосомы. В сыворотках крови пациентов с гепатитом С обнаружены экзосомы, содержащие РНК ВГС в комплексе с микроРНК (miR-122), белком теплового шока HSP90 и белком argonaute-2 (Ago2). Экзосомы способны проникать в незаражённые клетки, в том числе в гепатоциты, путём эндоцитоза. В гепатоцитах, захвативших экзосомы, содержащие вирусную РНК, наблюдается продуктивная ВГС-инфекция, которая может передаваться через вирусные частицы в высвобождающихся экзосомах. Таким образом, распространение вируса возможно через экзосомы, минуя клеточные рецепторы. НК – нуклеокапсид ВГС, ЭР – эндоплазматический ретикулум, КГ – комплекс Гольджи, МВТ – мультивезикулярные тельца (по T.N. Bukong и соавт. [59]).

 

Потенциал экзосом в терапии гепатита С

Протеомный анализ выявил около 250 белков в ВВ, полученных из первичных гепатоцитов крысы [62]. В циркулирующих ВВ здоровых людей идентифицировано около 70 белков, большинство из которых участвуют в транспорте везикул [63]. Помимо классических маркеров, обнаруженных в большинстве ВВ из других типов клеток, в экзосомах из гепатоцитов обнаружены и специфичные компоненты. Кроме того, практически все типы иммунных клеток, включая Т- и В-лимфоциты, дендритные клетки, макрофаги, клетки Купфера и нейтрофилы, продуцируют экзосомы. В связи с этим большой интерес представляют исследования, направленные на выяснение связи между патологическими изменениями в печени и содержимом экзосом из клеток печени больных гепатитом. Исследования показали, что ВВ/экзосомы, высвобождающися из гепатоцитов, в отличие от экзосом из других клеток печени, имеют повышенный уровень изоформы 2Е1 цитохрома Р450 (CYP 2Е1) и асиалогликопротеинового рецептора 1 [24]. Предполагают, что печень высвобождает CYP-содержащие ВВ для стимулирования метаболизма лекарств в других клетках, которые поглощают эти везикулы. В работе также приводится перечень молекул, обнаруженных в ВВ, которые ассоциированы с развитием патологий печени [24]. Клетки печени могут быть как донорами, так и реципиентами экзосом, что определяет сложные связи между различными клетками печени, которые осуществляются белками, а также мРНК и микроРНК. Экзосомы потенциально могут использоваться как биомаркеры при различных заболеваниях печени [64]. Так, при гепатите С в экзосомах из сыворотки крови определили увеличение содержания четырёх miR; при алкогольном гепатите экзосомы, полученные из гепатоцитов, содержат miR, которые ассоциируются с гипервоспалением; при гепатоцеллюлярной карциноме в экзосомах обнаруживали молекулы CEACAM1/6 (Carcinoembryonic antigen-related cell adhesion molecules), связанные с прогрессированием опухоли [64].

Отмечают, что использование ВВ имеет ряд преимуществ по сравнению со свободными белками и нуклеиновыми кислотами, в том числе:

1) нуклеиновые кислоты не реплицируются после введения;

2) содержащиеся в экзосомах вещества могут обладать более низкой иммуногенностью;

3) обладают высокой способностью преодолевать тканевые и клеточные барьеры;

4) устойчивы к деградации протеазами в циркуляции и к замораживанию/оттаиванию при длительном хранении [65].

Один из терапевтических подходов для подавления персистентной ВГС-инфекции предлагается в работе [66]. Показано, что соединения, нарушающие эндосомальный путь формирования экзосом и выход везикул из клетки, значительно подавляют репликацию вируса в клетках Huh7.5, заражённых химерным ВГС, содержащим зелёный флуоресцирующий белок (GFP), и при этом не влияют на жизнеспособность самих клеток. Другие подходы могут быть направлены на удаление циркулирующих экзосом, содержащих вирионы или РНК ВГС, а также на предотвращение их вхождения в клетки-мишени. «Вредные» экзосомы можно вывести из кровообращения, например, с использованием методов, аналогичных удалению циркулирующих антител с помощью экстракорпорального диализа. Описаны и другие стратегии снижения или отбора конкретных типов экзосом [67, 68]. Большинство работ по оценке роли экзосом в терапии гепатита С выполнены с использованием мезенхимальных стволовых/стромальных клеток (МСК). Клеточная терапия на основе МСК привлекает многих исследователей, экзогенные или активированные эндогенные МСК используются более чем в 1200 клинических испытаниях [69]. Клинические исследования показали, что терапия МСК уменьшает повреждение печени, улучшает её функцию и способствует регенерации тканей. При острой или хронической печёночной недостаточности применение МСК повышает выживаемость пациентов и обладает хорошей переносимостью и безопасностью [70]. X. Qian и соавт. в 2016 г. впервые показали способность экзосом, продуцируемых МСК, подавлять ВГС-инфекцию [71]. В этих экспериментах экзосомы, секретируемые из МСК пуповины (uMSC-Exo), были не токсичны и ингибировали репликацию ВГС in vitro. Этому способствовали определённые miR из экзосом. Кроме того, экзосомы из uMSC усиливали эффект ИФН-α и телапревира, используемых для лечения ХГС.

Серьёзную проблему для лечения всех заболеваний печени, в том числе гепатита С, представляет фиброз печени, возникающий при хроническом повреждении органа. Ключевую роль в этом процессе играют активированные стеллатные клетки печени (СКП), которые превращаются в миофибробласты, усиливающие отложение внеклеточного матрикса в печени и, как следствие, прогрессию фиброза [72]. ВВ и экзосомы могут играть разнонаправленные роли в фиброзе печени. Авторы [73] показали, что miR-19a из ВГС-инфицированных гепатоцитов активирует путь STAT3-TGF-β и в результате СКП. MiR-192 из клеток, инфицированных ВГС in vitro, также была способна активировать СКП путём повышения уровня TGFβ в стеллатных клетках [74]. В других исследованиях получены противоположные эффекты. Экзосомы, полученные из стволовых клеток печени человека, подавляли профиброзную активность стеллатных клеток in vivo [75], и этот эффект связывали с доставкой антифиброзных miR-146a-5p через экзосомы [76]. Сообщалось, что экзосомы из МСК костного мозга могут ингибировать активацию СКП in vivo и in vitro через путь Wnt/β-катенина [77]. Показано, что miR-486-5p, содержащаяся в экзосомах из МСК миндалин человека, связывается с 3’-нетранслируемой областью (UTR) мРНК SMO и ингибирует его экспрессию, и это приводит к инактивации СКП [78]. Определено, что при фиброзе печени miR-150-5p слабо экспрессирована, а хемокин CXCL1 экспрессирован сильно. Перенос miR-150-5p в СКП с помощью ВВ, выделяемых из МСК, ингибировало активацию СКП путём подавления экспрессии CXCL1 [79]. ВВ из сывороток здоровых мышей вводили мышам с экспериментально вызванным фиброзом печени и наблюдали снижение уровней гибели гепатоцитов, воспаления, ферментов аспартатаминотрасферазы/аланинаминотрансферазы и провоспалительных цитокинов в печени и периферической крови. ВВ из сывороток фиброзных мышей такого действия не оказывали [80]. Показано, что основными мишенями ВВ были активированные СКП. В ВВ нормальных мышей по сравнению с ВВ фиброзных мышей были более высокие уровни ряда miR. Каждая miR могла независимо подавлять экспрессию фиброгенных генов в активированных СКП. Сходные результаты получены с человеческими активированными СКП в культуре: ВВ из сывороток здоровых людей снижали уровень активации СКП и содержали более высокие уровни miR, чем ВВ от пациентов с фиброзом печени.

Оценка роли ВВ/экзосом в фиброзе печени позволяет заключить, что:

1) на СКП и развитие фиброза могут влиять ВВ и экзосомы из различных источников – МСК, гепатоцитов, плазмы крови, иммунных клеток;

2) действие ВВ и экзосом происходит путём переноса содержащихся в них биологически активных молекул, в том числе белков, мРНК, miR в активированные СКП;

3) ВВ и экзосомы, проникшие в активированные СКП, способны ингибировать молекулярные пути, в которых участвуют LPS/TLR, STAT3/Bcl-2/Beclin-1, TGFβ/SMAD, Wnt/Beta-catenin и др.;

4) при фиброзе печени поглощение ВВ активированными СКП снижает их пролиферацию, созревание коллагена, уровень провоспалительных цитокинов и повышает аутофагию.

Таким образом, миофибробласты могут вернуться в состояние покоя [81]. Высказывается предположение, что сывороточные ВВ и экзосомы от здоровых людей по своей природе являются антифиброгенными и антифиброзными и содержат miR, которые оказывают терапевтическое действие на активированные стеллатные клетки или повреждённые гепатоциты [80]. Отмечается, что специфические изменения состава (профиля) miR в ВВ могут рассматриваться как возможные диагностические биомаркеры для дифференциации различных типов и стадий прогрессирования хронических гепатитов [82]. В то же время результаты исследования [83] показали, что ВВ/экзосомы, содержащие определённые miR, могут рассматриваться и как потенциальные терапевтические агенты. Интересные данные получены при изучении натуральных киллеров (NK-клеток), которые участвуют в активации СКП [84] и могут влиять на функции клеток-мишеней через секрецию экзосом [85]. Определено, что NK-клетки (линия NK-92MI) экскретируют экзосомы (NK-Exo). После очистки NK-Exo вносили в культуру активированных СКП человека линии LX-2 и мышам с CCl4-индуцированным фиброзом (рис. 4). Обработка NK-Exo значительно подавляла пролиферацию и активацию СКП in vitro. Кроме того, NK-Exo снижали уровень фиброза у мышей [86]. Предположительно эффект связан с действием miR-223, которая экспрессируется в экзосомах NK-Exo на высоком уровне. Действительно, подавление экспрессии miR-223 в NK-Exo отменяло ингибирующее действие NK-Exo на активацию СКП. C помощью программы Targetscan установлено, что предполагаемой мишенью miR-223 является ATG7 – один из маркеров аутофагии [87]. Экспериментальный анализ показал, что ATG7 является прямой мишенью miR-223. Так как аутофагия может участвовать в активации СКП, можно сделать вывод, что экзосомы из NK-клеток подавляют активацию CКП именно за счёт переноса miR-223, которая ингибировала аутофагию в результате взаимодействия с ATG7 [88]. Эти данные сходны с результатами, показавшими, что блокирование аутофагии ингибирует развитие фиброза печени [89, 90]. Полученные результаты свидетельствуют о перспективности дальнейших исследований по разработке системы доставки экзосом для лечения патологий печени, включая хронические вирусные гепатиты. В то же время вопрос о том, каким образом клетки-реципиенты распознают ВВ и как ВВ взаимодействуют с клетками-мишенями in vivo, пока не решён. Упоминаются разные молекулы на поверхности клеток-реципиентов, с которыми могут связываться ВВ [91]. Модель для изучения функции ВВ in vivo разработали на основе анализа экспрессии CD63-фторина у эмбрионов рыбок данио. Обнаружив экзосомы в циркуляции, авторы определили, что в эндоцитозе везикул участвуют патрулирующие макрофаги и эндотелиальные клетки в хвостовой части эмбриона [92]. Роль макрофагов в распознавании экзосом отмечена также в работе на мышах [93], показавшей, что в распознавании макрофагами внутривенно введённых экзосом важен отрицательный заряд фосфатидилсерина в экзосомных мембранах.

 

Рис. 4. Экзосомы из клеток натуральных киллеров (NK) снижают уровень экспериментального фиброза печени. Неактивные стеллатные клетки печени человека линии LX-2 активировали с помощью TGF-β1 и затем обрабатывали экзосомами, выделенными из клеток NK – NK-Exo. В результате активность стеллатных клеток была подавлена. Введение NK-Exo мышам с экспериментально вызванным фиброзом приводило к снижению уровня фиброза. Антифиброзное действие NK-Exo ассоциировалось с высоким уровнем экспрессии микроРНК miR-223, направленной на белок аутофагии ATG7 и подавление его функции. Блокада аутофагии вызывала снижение уровня фиброза печени (по L. Wang и соавт. [86, 88]).

 

Рассматривая экзосомы, ВВ, а также ВВ, выделяемые из МСК (МСК-ВВ), отмечают растущий интерес к роли МСК-ВВ в заболеваниях печени [94]. МСК-ВВ более удобны и менее иммуногенны, чем МСК, не приживляются, имеют высокий тропизм к печени, не вызывают аберрантной дифференцировки стволовых клеток, не проявляют иммуногенности и риска канцерогенеза. Бесклеточная терапия МСК-ВВ, а также ВВ, модифицированные противовирусными молекулами, открывают новые перспективы для лечения заболеваний печени.

Экзосомы для профилактики гепатита C

Свойства экзосом позволяют рассматривать их как потенциальные вакцины. Однако пока работ в этом направлении не много. Отмечается, что, благодаря способности циркулировать в организме и достигать периферические органы, экзосомы способны улучшить распределение антигенов [95]. Показано, что экзосомы из инфицированных ВГС клеток, содержащие РНК ВГС, могут индуцировать продукцию ИФН-α в неинфицированных плазмацитоидных дендритных клетках [60]. Экспорт вирусной РНК с экзосомами может служить как стратегией вируса для уклонения от обнаружения патогена, так и стратегией хозяина для индукции иммунного ответа. Показана способность экзосом проникать в гепатоциты, инфицированные вирусом гепатита В, и передавать ИФН-α, активируя соответствующий противовирусный каскад [96]. Этот и другие результаты предполагают, что экзосомы могут быть не только переносчиками антигенов, но и индукторами иммунного ответа.

Экзосомы и коронавирусная инфекция

Коронавирусы могут входить в клетку путём либо прямого слияния вирусной мембраны с плазматической мембраной клетки, либо эндоцитоза. Получены данные о возможном участии экзосом во вхождении коронавируса в клетки-мишени. Установлено, что в состав белковых комплексов с клеточными рецепторами коронавирусов и протеазой TMPRSS2 входят тетраспанины CD9, которые, наряду с CD81 и CD63, встроены в мембраны экзосом [97]. Образовавшиеся комплексы обеспечивают быстрое и эффективное вхождение коронавирусов. При отсутствии CD9 вирусы проникают с участием катепсинов, но гораздо позже и менее эффективно [98]. Экзосомы, высвободившиеся из клеток, инфицированных коронавирусом, могут способствовать проникновению вируса в неинфицированные клетки путём переноса молекул CD9.

Экзосомы в патогенезе COVID-19

Экзосомы у больных COVID-19 могут содержать вирусные РНК, белки и даже вирионы SARS-CoV-2 [99, 100]. В одной из работ, выполненных в этом направлении [101], выделяли экзосомы из плазмы крови 20 пациентов с COVID-19 и 8 здоровых волонтеров и провели протеомный анализ содержимого экзосом. Показано, что содержание 163 белков из 1637 идентифицированных значительно превышает таковое в экзосомах здоровых лиц. Содержание двух белков – тенасцина-С (TNC) и фибриногена-β (FGB) изменялось особенно сильно – более чем в 200 и 700 раз соответственно. Для выяснения возможности переноса содержимого экзосом в другие клетки использовали иммортализованные гепатоциты IHH и Huh7. В клетках обеих линий наблюдали присутствие TNC и FGB, причём более высокое содержание этих белков обнаружили в гепатоцитах, обработанных экзосомами от пациентов с COVID-19. Так как TNC – иммуномодулятор, который может индуцировать хроническое воспаление [102], а повышенный уровень FGB в крови связан с сосудистыми нарушениями, наблюдаемыми при COVID-19, исследовали возможную связь экзосом с воспалением. Для этого была изучена экспрессия фактора некроза опухоли α (TNF-α), интерлейкина 6 (IL-6) и хемокинового лиганда 5 (CCL5) в гепатоцитах, подвергшихся воздействию экзосом от пациентов с COVID-19 и от здоровых лиц. Оказалось, что экспрессия цитокинов и хемокина в гепатоцитах была значительно повышена только после обработки экзосомами от пациентов с COVID-19 и ассоциировалась с активацией NF-κB в гепатоцитах (рис. 5 a). Это указывает на потенциальную возможность экзосом из плазмы крови больных COVID-19 индуцировать продукцию провоспалительных цитокинов и вызывать клинические проявления заболевания, ассоциированного с SARS-CoV-2 не только в лёгких, но и в гепатоцитах – клетках удалённого органа. Этот вывод подтверждается наблюдениями о внелёгочных проявлениях COVID-19 [103].

 

Рис. 5. Участие экзосом в патогенезе COVID-19: а – экзосомы, секретируемые клетками, инфицированными SARS-CoV-2, обогащены тенасцином-С (TNC) и фибриногеном-β (FGB) и, проникая в гепатоциты, инициируют продукцию TNF-α, IL-6 и CCL5 в гепатоцитах (по S. Sur и соавт. [101]); б – экзосомы, содержавшие гены SARS-CoV-2, вносили в культуру кардиомиоцитов и наблюдали в них экспрессию вирусных генов и значительное увеличение экспрессии генов провоспалительных цитокинов и хемокинов (по Y. Kwon и соавт. [104]); в – клеточный рецептор АСЕ2, взаимодействует с рецептор-связывающим доменом (RBD) S-белка SARS-CoV-2, что вызывает заражение клеток (слева); в крови пациентов с COVID-19 обнаружили экзосомы, содержащие ACE2, и показали, что они конкурируют с клеточным рецептором ACE2, блокируя связывание S-белка с ACE2 клеток и нейтрализуя инфекционную активность вируса (справа) (по L. El-Shennawy и соавт. [107]); г – в сыворотках крови пациентов с COVID-19 обнаружили увеличение количества экзосом, несущих на поверхности ганглиозиды GM3, присутствие которых сопровождалось увеличением С-реактивного белка (СРБ), интерлейкина 6 (IL-6) и скорости оседания эритроцитов (СОЭ), снижением количества CD4+-клеток, а также коррелировало со степенью тяжести заболевания (по J.W. Song и соавт. [109]); д – экзосомы, высвобождающиеся из эндотелиальных клеток и тромбоцитов в циркуляцию у пациентов с COVID-19, содержат активные молекулы CD142 и обладают повышенной провоспалительной и прокоагулянтной активностью, прямо связаны с тяжестью заболевания (по W. Holnthoner и соавт. [114] и C. Balbi и соавт. [115]).

 

Роль ВВ/экзосом в инфекции SARS-CoV-2 изучалась также в опытах с эпителиальными клетками лёгких A549 [104]. Показано, что после трансдукции лентивирусом, кодирующим два неструктурных (Nsp1 and Nsp12) и два структурных (envelope E и nucleocapsid N) белка SARS-CoV-2, ВВ, выделенные из клеток А549, содержат вирусную РНК (рис. 5 б). ВВ использовали для обработки кардиомиоцитов, полученных из индуцированных плюрипотентных стволовых клеток человека (hiPSC-CMs). Методом qRT-PCR в кардиомиоцитах были обнаружены мРНК всех четырёх вирусных генов. Кроме того, в кардиомиоцитах, содержащих Nsp1, значительно увеличивалась экспрессия провоспалительных генов IL-1β, IL-6 и MCP1. Полученные данные указывают на то, что клетки, которые не экспрессируют рецептор ACE2 SARS-CoV-2, могут получать вирусную генетическую информацию путём поглощения ВВ/экзосом, а экспрессия вирусных генов может способствовать усилению воспаления, что характерно для патогенеза COVID-19. В то же время ВВ/экзосомы могут доставлять АСЕ2 в клетки, которые не экспрессируют или слабо экспрессируют рецептор SARS-CoV-2, транспортируя белок от других клеток [105]. В плазме крови пациентов с COVID-19 идентифицировали экзосомы, содержащие АСЕ2 (ACE2+), и показали [106], что экзосомы ACE2+ конкурируют с клеточным ACE2 за нейтрализацию SARS-CoV-2, дозозависимо блокируя связывание вирусного S-белка с клетками ACE2+ (рис. 5 в). Экзосомы, содержащие АСЕ2, в 120–135 раз более эффективно блокировали связывание рецептор-связывающего домена (RBD) S-белка по сравнению с рекомбинантным человеческим ACE2 (rhACE2), не связанным с везикулами [107]. Кроме того, экзосомы ACE2+ в 60–80 раз более эффективно защищали трансгенных мышей, экспрессирующих ген асе2 человека, от повреждения лёгких и гибели после интраназального заражения SARS-CoV-2. Экзосомы ACE2+ ингибировали инфекцию вариантов α, β и δ SARS-CoV-2, содержащих мутации в RBD, с равной или более высокой эффективностью, чем штамм дикого типа. Этот результат показал, что экзосомы, содержащие ACE2, могут служить основой для разработки терапевтических средств широкого спектра действия против существующих и будущих коронавирусов, которые используют рецептор ACE2 [108].

Интересные данные получены при обследовании пациентов с COVID-19 с различной степенью тяжести заболевания [109]. Представлены количественные данные изучения 1002 метаболитов в плазме крови, показавшие значительное увеличение содержания ганглиозидов GM3, которое коррелировало со снижением количества циркулирующих CD4⁺-Т-клеток у пациентов с COVID-19 и прогрессирующим увеличением показателей системного воспаления, включая С-реактивный белок, IL-6, скорость оседания эритроцитов, сывороточный ферритин и прокальцитонин по мере увеличения тяжести заболевания. Сравнительный анализ выявил сильную связь между тяжестью заболевания и обнаружением в сыворотках крови экзосом, несущих ганглиозиды (GM3) (рис. 5 г). Показано, что GD3, присутствующие на поверхности экзосом в микроокружении опухоли, подавляют функции Т-клеток, способствуя иммуносупрессии [110]. Ганглиозиды присутствуют во всех клетках позвоночных, экспрессируются на наружной поверхности плазматических мембран клеток [111], специфически связываются с регуляторными белками и другими молекулами, модулируют активность белков клеточной поверхности и действуют как рецепторы при межклеточных взаимодействиях, являются мишенями для патогенов, в том числе SARS-CoV-2 [112]. Таким образом, обнаруженные в циркуляции экзосомы, содержащие ганглиозиды, могут утяжелять течение COVID-19 через нарушение клеточных регуляторных путей и иммунного ответа [113].

Одним из проявлений COVID-19 является образование тромбов. Клиническое исследование показало, что у пациентов с COVID-19 в циркуляции присутствуют ВВ, cодержащие активные молекулы CD142, тесно связанные с повышенной прокоагулянтной активностью (рис. 5 д). Высвобождение ВВ, содержащих CD142, из эндотелиальных клеток ассоциируется с провоспалительной активностью [114]. На состояние сосудистой системы при COVID-19 влияют также ВВ из тромбоцитов, нагруженные CD142. В циркуляции больных COVID-19 количество таких везикул значительно увеличивается. Определена прямая взаимосвязь между циркулирующими ВВ, происходящими из тромбоцитов, и тяжестью заболевания, что послужило основанием предложить эти везикулы в качестве биомаркеров для прогнозирования исходов у пациентов c COVID-19 [99, 115–117].

Суммируя, можно заключить, что участие экзосом, выделенных из клеток пациентов, инфицированных SARS-CoV-2, в патогенезе COVID-19 определяетcя:

а) содержанием вирусных РНК, белков и вирионов;

б) переносом вирусных компонентов от мест проникновения (эпителий дыхательных путей) в другие органы;

в) способностью изменять экспрессию клеточных генов, вовлечённых в патогенез COVID-19;

г) усилением сосудистой дисфункции и цитокинового шторма.

Экзосомы в терапии и профилактике COVID-19

Широкий спектр вакцин, используемых в настоящее время, снижает уровень инфицирования SARS-CoV-2, однако остаётся необходимость в лечении значительного числа пациентов, у которых развиваются пневмония и другие серьезные заболевания. Среди многочисленных средств, предлагаемых для терапии, десятки опубликованных работ, а также клинических испытаний посвящены изучению возможности использования МСК различного происхождения [69]. Показано, что МСК подавляют воспаление, улучшают состояние лёгких, не вызывают побочных эффектов и статистически значимо снижают смертность пациентов с COVID-19 [118]. Авторы заключили, что использование МСК является безопасным и эффективным методом лечения COVID-19. Исследования продолжаются, так как ни одно из тестируемых средств пока не получило разрешение на использование в терапии COVID-19.

В последнее время внимание исследователей привлекает бесклеточная терапия, которая имеет ряд преимуществ по сравнению с терапией МСК [119]. Она включает секретом МСК (набор факторов и биомолекул, секретируемых клетками) и ВВ/экзосомы, высвобождаемые из МСК. Анализ действия секретом МСК на повреждённые лёгкие крыс показал улучшение структуры лёгких, уменьшение α-SMA и снижение содержания коллагена. Это позволило предположить, что секретом МСК может представлять новый терапевтический подход к лечению такого серьёзного последствия COVID-19, как фиброз лёгких [120].

Предпосылками использования экзосом для лечения COVID-19 стали результаты работ, в которых анализировали действия экзосом при серьёзных повреждениях лёгких. Данные нескольких исследований показали, что ВВ/экзосомы, полученные из МСК костного мозга человека, оказывают положительное терапевтическое действие при остром повреждении лёгких и остром респираторном дистресс-синдроме у лабораторных животных [121]. Благодаря присутствию в экзосомах биологически активных молекул эти везикулы способны активировать регенерацию повреждённых тканей, подавлять выработку воспалительных цитокинов и модулировать функции иммунных клеток [122].

Одно из преимуществ экзосом состоит в их способности проникать в различные органы и ткани, что позволяет использовать их в качестве терапевтического средства при аэрозольной ингаляции (небулайзерная терапия) [123, 124]. Продемонстрировано, что ингаляция секретома и экзосом, полученных при культивировании клеток из лёгких мыши, содержащих эпителиальные, прогениторные клетки и МСК, способствует восстановлению лёгких при фиброзе. Наблюдается уменьшение накопления коллагена и пролиферации миофибробластов, восстанавливается типичная альвеолярная структура лёгких [125]. Ингаляционный способ введения менее болезненный, действует быстрее и при меньших дозах позволяет достичь такого же терапевтического эффекта, как при пероральной или инъекционной терапии [121].

Отмечают, что ВВ/экзосомы могут играть как положительную, так и отрицательную роль в коронавирусной инфекции. С одной стороны, ВВ могут подавлять инфекцию и предотвращать заражение, как это показано на примере ВВ, содержащих ACE2 или АСЕ2 + TMPRSS2 [126, 127]. С другой стороны, ВВ могут способствовать вирусной инфекции, захватывая и распространяя вирус или вирусные компоненты и защищая их от иммунной системы. Кроме того, предполагают, что в периферической крови больных с SARS-CoV-2 присутствуют антагонистические экзосомы, которые могут снижать вирус-нейтрализующую способность плазмы крови реконвалесцентов и, вероятно, действуют как конкурентный ингибитор нейтрализующих антител [128].

Экзосомы используют в клинических исследованиях, направленных на лечение COVID-19 [129]. Оценивают потенциал экзосом в трех направлениях:

1) как везикул, секретируемых МСК из разных источников;

2) как везикул, содержащих специфические микроРНК и мРНК;

3) как везикул, доставляющих лекарства для лечения COVID-19.

С появлением коммерческих препаратов экзосом их также включают в исследования эффективности лечения. Так, проведено изучение безопасности и эффективности применения экзосом (ExoFlo), полученных из аллогенных МСК костного мозга, при лечении 24 пациентов c тяжёлым течением COVID-19, а также острым респираторным дистресс-синдромом средней и тяжёлой степени [130]. Внутривенное введение ExoFlo показало безопасность препарата, способность восстанавливать оксигенацию, подавлять цитокиновый шторм и восстанавливать иммунитет. Авторы заключили, что ExoFlo является многообещающим кандидатным лечебным средством при тяжёлой форме COVID-19. Суммируя данные о действии экзосом на различные клетки в лёгочной ткани, инфицированной SARS-CoV-2, авторы заключили [129], что экзосомы способны: а) взаимодействовать как с S-белком SARS-CoV-2, так и с клеточным рецептором АСЕ2, конкурентно подавляя проникновение вируса; б) снижать уровни провоспалительных цитокинов в сосудистых и альвеолярных клетках; повышать функции макрофагов, интерферонов, В-клеток, модулируя иммунные реакции. Эти результаты подтверждают вывод о том, что экзосомы – перспективные кандидаты для разработки вакцин.

При первых оценках возможности использования экзосом для разработки вакцин против коронавирусов за основу был принят S-белок SARS-CoV-1, вызвавший вспышку SARS в 2002–2003 гг. [131]. Препараты экзосом, содержавших S-белок, вводили мышам и показали, что двух инъекций экзосом без адъювантов было достаточно, чтобы индуцировать нейтрализующие антитела к коронавирусу. Наибольший эффект был достигнут при иммунизации вначале экзосомами, а затем аденовирусным вектором, экспрессирующим белок S. Сравнивали нейтрализующую активность антител в сыворотках крови иммунизированных мышей и сыворотках от выздоравливающих пациентов с пневмонией, вызванной SARS-CoV-1. Обнаружено, что после первой иммунизации экзосомальной вакциной и повторной стимуляции аденовирусным вектором нейтрализующая активность антител превышала ту, которую наблюдали в сыворотке выздоравливающих пациентов. Высокая эффективность индукции гуморального ответа на введение экзосомальной вакцины, содержащей S-белок SARS-CoV-2, показала перспективность дальнейших исследований протективных свойств новых экзосомальных вакцин, способных предотвратить коронавирусные инфекции.

Большинство вакцин, используемых против SARS-CoV-2, предназначены для внутримышечного введения [132]. В 2022 г. сообщили о разработке и доклиническом испытании ингаляционной вакцины против COVID-19, которая после лиофилизации остаётся стабильной при комнатной температуре более трёх месяцев [133]. Вакцина содержит RBD SARS-CoV-2, конъюгированный с экзосомами из клеток лёгкого человека (рис. 6). Такая конструкция вакцины (экзосомы, содержащие на мембране RBD) увеличивает до 21 суток присутствие RBD как в слизистой оболочке дыхательных путей, так и в паренхиме лёгких. Ингаляционное введение вакцины вызывало у мышей специфические IgG-антитела к RBD в крови и IgA-антитела в слизистой оболочке. Наблюдалась индукция CD4⁺- и CD8⁺-Т-клеток, экспрессирующих провоспалительные цитокины в лёгких животных и очищение их от псевдовируса SARS-CoV-2 после заражения. У хомяков две дозы вакцины ослабили тяжёлую пневмонию и уменьшили воспалительные инфильтраты после заражения живым SARS-CoV-2. Экзосомы, содержащие на мембране рекомбинантный RBD SARS-CoV-2 (rRBD), заслуживают дальнейших испытаний как кандидатная ингаляционная вакцина против COVID-19. К преимуществам ингаляционной вакцины можно отнести натуральное происхождение наночастиц – экзосом, несущих вирусный антиген; быструю и непосредственную доставку экзосом в слизистую респираторного тракта; отсутствие температурных ограничений при хранении и доставке вакцины, а также неинвазивный способ введения.

 

Рис. 6. Схематическое изображение получения и действия ингаляционной вакцины против SARS-CoV-2. S-белок SARS-CoV-2 содержит домен, связывающий рецептор (RBD). Получен рекомбинантный белок RBD (rRBD). Методом малоинвазивной биопсии и трехмерного культивирования получали клетки лёгкого человека, из которых выделяли экзосомы. Экзосомы конъюгировали с rRBD SARS-CoV-2, который локализовался на мембране экзосомы. Путем ингаляции экзосомы вводили мышам и хомякам. У мышей экзосомная вакцина вызывала индукцию анти-RBD антител классов IgG и мукозных – IgA, увеличение количества клеток CD4+ и CD8+ и клиренс вируса после заражения SARS-CoV-2. У хомяков вакцина ослабляла тяжелую пневмонию, вызванную коронавирусом (по Z. Wang и и соавт. [186], модифицировано).

 

Заключение

Оценивая действие экзосом в вирусных инфекциях, следует отметить их двойственную роль. Способность поглощать и перемещать вирусные РНК- и ДНК-геномы, белки и вирусные частицы в неинфицированные клетки может способствовать генетической кооперации между квазивидами вирусов и улучшать их приспособленность и длительность пребывания в организме. Эти свойства позволили назвать ВВ/экзосомы троянскими конями в вирусной инфекции [134, 135]. Действительно, вирусы могут использовать экзосомы для распространения, усиления инфекции, а также защиты от иммунного ответа хозяина. В то же время получены данные о способности экзосом противодействовать вирусным инфекциям. Так, показано, что экзосомы содержат множество противовирусных факторов, которые ингибируют репликацию ВИЧ-1 [136], в том числе воздействуя на вирусный ген tat и его комплексы с клеточными генами [137, 138]. Положительное действие экзосом, продуцируемых МСК, отмечено в клинических испытаниях при острых респираторных заболеваниях [139, 140]. Экзосомы, выделенные из культуры первичных трофобластов человека, обеспечивали резистентность клеток-реципиентов к ряду изученных вирусов, в том числе вирусу осповакцины, вирусу простого герпеса 1-го типа и цитомегаловирусу.

Таким образом, процессы, в которых участвуют экзосомы, могут играть как положительную, так и отрицательную роль в патогенезе вирусных инфекций, либо способствуя развитию инфекции, либо сдерживая её развитие [141]. Важное направление использования экзосом связано с содержанием в них маркеров вирусов и вирусных инфекций, что создаёт возможность применения экзосом в качестве жидкой биопсии и неинвазивной диагностики. Натуральное происхождение из клеток человека и высокая биосовместимость позволяют применять экзосомы для доставки лекарственных препаратов. Генетически модифицированные экзосомы могут служить основой для создания терапевтических средств и противовирусных вакцин. Очевидно, что позитивное и негативное участие экзосом в патогенезе вирусных инфекций в настоящее время недостаточно изучено и требует дальнейших расширенных исследований. Так, использование экзосом для лечебных и профилактических целей может быть опасным в связи с формированием аутоиммунных реакций из-за наличия в их структуре компонентов (в том числе и белков) человека. Усовершенствование методов выделения, очистки и стандартизации везикул, а также дальнейшие многосторонние исследования их свойств открывают перспективы для использования экзосом в борьбе с вирусными инфекциями.

Об авторах

Алла Александровна Кущ

ФГБУ «Национальный исследовательский центр эпидемиологии и микробиологии имени почетного академика Н.Ф. Гамалеи» Минздрава России

Автор, ответственный за переписку.
Email: vitallku@mail.ru
ORCID iD: 0000-0002-3396-5533
SPIN-код: 6964-1715

д-р биол. наук, проф., ведущий научный сотр.

Россия, 123098, г. Москва

Александр Владимирович Иванов

ФГБУН «Институт молекулярной биологии им. В.А. Энгельгардта Российской академии наук»

Email: aivanov@yandex.ru
ORCID iD: 0000-0002-5659-9679
SPIN-код: 5776-5496

доктор биологических наук, главный научный сотрудник, рук. лаборатории биохимии вирусных инфекций, зам. директора по научной работе

Россия, 119991, г. Москва

Список литературы

Дополнительные файлы