Problems of VirologyProblems of VirologyВопросы вирусологии0507-40882411-2097Central Research Institute for Epidemiology66510.36233/0507-4088-149ORIGINAL RESEARCHESОРИГИНАЛЬНЫЕ ИССЛЕДОВАНИЯResearch ArticleAdjuvant effect of dispersed fullerene C60 on the immune response to constructs harboring amino acid and nucleotide sequences of hepatitis C virus nonstructural NS5B proteinАдъювантное действие дисперсного фуллерена С60 на иммунный ответ против конструкций, имитирующих аминокислотные и нуклеотидные последовательности неструктурного белка NS5B вируса гепатита Сhttps://orcid.org/0000-0001-5571-56697210-0870MasalovaOlga V.МасаловаОльга Владимировна
Russian Federation

Dr. Sci. (Biology), Leading Researcher, Head of the Laboratory

д-р биол. наук, ведущий научный сотр., зав. лаб.

ol.mas@mail.ruhttps://orcid.org/0000-0002-2801-68439901-8607LesnovaEkaterina I.ЛесноваЕкатерина Ивановна
Russian Federation

Researcher

научный сотр.

wolf252006@yandex.ruhttps://orcid.org/0000-0001-8297-579X2542-5260AndreevSergey M.АндреевСергей Михайлович
Russian Federation

PhD, Head of the Laboratory

канд. хим. наук, зав. лаб.

sm.andreevj@nrcii.ruhttps://orcid.org/0000-0001-6444-64997555-5925ShershakovaNadezhda N.ШершаковаНадежда Николаевна
Russian Federation

PhD, Head of the Laboratory

канд. биол. наук, зав. лаб.

nn.shershakova@nrcii.ruhttps://orcid.org/0000-0002-0502-48246821-2115KozlovVyacheslav V.КозловВячеслав Владимирович
Russian Federation

Researcher

научный сотр.

hyperslava@yandex.ruhttps://orcid.org/0000-0002-3579-44166220-3425PermyakovaKristina Yu.ПермяковаКристина Юрьевна
Russian Federation

Junior Researcher, Senior Lecturer

мл. науч. сотр., ст. преподаватель кафедры иммунологии и биотехнологии

kristusha164@mail.ruhttps://orcid.org/0000-0003-1961-97898759-0277DemidovaNatalia A.ДемидоваНаталья Андреевна
Russian Federation

Researcher

научный сотр.

ailande@yandex.ruhttps://orcid.org/0000-0003-0365-570X3492-4501Valuev-EllistonVladimir T.Валуев-ЭллистонВладимир Треворович
Russian Federation

PhD, Researcher

канд. биол. наук, научный сотр.

gansfaust@mail.ru1006824TuretskiyEvgeny A.ТурецкийЕвгений Александрович
Russian Federation

PhD

канд. фарм. наук, мл. науч. сотр.

ea.turetskiy@nrcii.ruhttps://orcid.org/0000-0002-5659-96795776-5496IvanovAlexander V.ИвановАлександр Владимирович
Russian Federation

PhD, Leading Researcher

канд. хим. наук, ведущий научный сотрудник

aivanov@yandex.ruhttps://orcid.org/0000-0001-6226-72516679-1727NikolaevaTatyana N.НиколаеваТатьяна Николаевна
Russian Federation

Dr. Sci. (Medicine), Head of the Laboratory

д-р мед. наук, зав. лаб.

tatyananik.55@mail.ru3199-9803KhaitovMusa R.ХаитовМуса Рахимович
Russian Federation

RAS Corr. Member, Professor, Dr. Sci. (Medicine), Director

член-корр. РАН, д-р мед. наук, проф., директор

mr.khaitov@nrcii.ruhttps://orcid.org/0000-0001-5266-97835736-5260ProninAlexander V.ПронинАлександр Васильевич
Russian Federation

Professor, Dr. Sci. (Biology), Director

д-р биол. наук, проф., директор, зам. директора

proninalexander@yandex.ruhttps://orcid.org/0000-0002-3396-55336964-1715KushchAlla A.КущАлла Александровна
Russian Federation

Professor, Dr. Sci. (Biology), Leading Researcher

д-р биол. наук, проф., ведущий научный сотр.

vitallku@mail.ruGamaleya NRC of Epidemiology and Microbiology, Ministry of Health of the Russian FederationФГБУ «Национальный исследовательский центр эпидемиологии и микробиологии имени Н.Ф. Гамалеи» Минздрава РоссииNRC Institute of Immunology FMBA of RussiaФГБУ «Государственный научный центр «Институт иммунологии» ФМБА РоссииFederal State Budgetary Educational Institution of Higher Education «Moscow State Academy of Veterinary Medicine and Biotechnology — MVA by K.I. Skryabin»ФГБОУ ВО «Московская государственная академия ветеринарной медицины и биотехнологии – МВА имени К.И. Скрябина» Министерства сельского хозяйства Российской ФедерацииEngelhardt Institute of Molecular Biology, Russian Academy of SciencesФГБУН «Институт молекулярной биологии имени В.А. Энгельгардта» Российской академии наукSechenov First Moscow State Medical University (Sechenov University)ФГАОУ ВО «Первый Московский государственный медицинский университет имени И.М. Сеченова» Минздрава России (Сеченовский Университет)Pirogov Russian National Research Medical UniversityФГАОУ ВО «Российский национальный исследовательский медицинский университет имени Н.И. Пирогова» Минздрава России0712202267651652626122022Copyright ©; 2022, Masalova O.V., Lesnova E.I., Andreev S.M., Shershakova N.N., Kozlov V.V., Permyakova K.Y., Demidova N.A., Valuev-Elliston V.T., Turetskiy E.A., Ivanov A.V., Nikolaeva T.N., Khaitov M.R., Pronin A.V., Kushch A.A.Copyright ©; 2022, Масалова О.В., Леснова Е.И., Андреев С.М., Шершакова Н.Н., Козлов В.В., Пермякова К.Ю., Демидова Н.А., Валуев-Эллистон В.Т., Турецкий Е.А., Иванов А.В., Николаева Т.Н., Хаитов М.Р., Пронин А.В., Кущ А.А.2022Masalova O.V., Lesnova E.I., Andreev S.M., Shershakova N.N., Kozlov V.V., Permyakova K.Y., Demidova N.A., Valuev-Elliston V.T., Turetskiy E.A., Ivanov A.V., Nikolaeva T.N., Khaitov M.R., Pronin A.V., Kushch A.A.Масалова О.В., Леснова Е.И., Андреев С.М., Шершакова Н.Н., Козлов В.В., Пермякова К.Ю., Демидова Н.А., Валуев-Эллистон В.Т., Турецкий Е.А., Иванов А.В., Николаева Т.Н., Хаитов М.Р., Пронин А.В., Кущ А.А.https://creativecommons.org/licenses/by/4.0https://virusjour.crie.ru/jour/article/view/665

Introduction. A vaccine against hepatitis C has not yet been developed. Recombinant proteins and plasmids encoding hepatitis C virus (HCV) proteins, the components of candidate vaccines, induce a weak immune response and require the use of adjuvants.

The aim of the work was to study the adjuvant action of an aqueous solution of fullerene C60 during immunization of mice with HCV recombinant protein NS5B (rNS5B) that is an RNA-dependent RNA polymerase, or with NS5B-encoding pcNS5B plasmid.

Materials and methods. An aqueous solution of dispersed fullerene (dnC60) was obtained by ultrafiltration. C57BL/6 mice were immunized with rNS5B subcutaneously, pcNS5B – intramuscularly mixed with different doses of dnC60 three times, then the humoral and cellular response to HCV was evaluated.

Results. Mice immunization with rNS5B in a mixture with dnC60 at doses of 2–50 µg/mouse significantly induced humoral response: a dose-dependent increase in IgG1 antibody titers was 7–20 times higher than in the absence of fullerene. There was no increase in the cellular response to rNS5B when administered with dnC60. The humoral response to DNA immunization was weak in mice of all groups receiving pcNS5B. The cellular response was suppressed when the plasmid was injected in a mixture with dnC60.

Conclusions. Dispersed fullerene dnC60 is a promising adjuvant for increasing the immunostimulating activity of weakly immunogenic proteins including surface and other HCV proteins, important for a protective response. Further research is needed to enhance the ability of dnC60 to boost the cellular immune response to the components of the candidate vaccine.

Введение. Вакцина против гепатита С пока не разработана. Рекомбинантные белки и плазмиды, кодирующие белки вируса гепатита С (ВГС), – компоненты кандидатных вакцин – индуцируют слабый иммунный ответ и требуют использования адъювантов.

Цель работы – изучить адъювантную способность водного раствора фуллерена С60 при иммунизации мышей рекомбинантным белком NS5B (rNS5B) ВГС – РНК-зависимой РНК-полимеразой, а также плазмидой pcNS5B, экспрессирующей этот белок.

Материалы и методы. Водный раствор дисперсного фуллерена (dnC60) получен методом ультрафильтрации. Мышей C57BL/6 иммунизировали rNS5B подкожно, pcNS5B – внутримышечно в смеси с разными дозами dnC60 трёхкратно, затем оценивали гуморальный и клеточный ответ на ВГС.

Результаты. Показано, что иммунизация мышей rNS5B в смеси с dnC60 в дозах 2–50 мкг/мышь приводила к значительной индукции гуморального ответа: дозозависимый прирост титров антител IgG1 был в 7–20 раз выше. Усиления клеточного ответа к rNS5B при введении с dnC60 не наблюдалось: продукция IFN-γ лимфоцитами, стимулированными in vitro, не увеличивалась; антитела изотипа IgG2a – маркера Th1 звена иммунного ответа – не обнаруживались. Гуморальный ответ на ДНК-иммунизацию был слабым у мышей всех групп, получавших pcNS5B. Клеточный ответ при введении плазмиды в смеси с dnC60 подавлялся. Показана обратная зависимость индекса стимуляции пролиферации лимфоцитов в ответ на специфические стимуляторы in vitro от дозы dnC60, снижение количества клеток, синтезирующих IFN-γ, в реакции ELISpot, сокращение популяции CD8+-лимфоцитов.

Заключение. Дисперсный фуллерен dnC60 представляется весьма обещающим адъювантом для повышения иммуностимулирующей активности слабоиммуногенных белков, к которым относятся белки ВГС, включая поверхностные, важные для протективного ответа. Для повышения способности dnC60 усиливать клеточный иммунный ответ на компоненты кандидатной вакцины необходимы дальнейшие исследования.

hepatitis C virusnonstructural NS5B proteinDNA immunizationfullerene C60adjuvantsimmune responseвирус гепатита Снеструктурный белок NS5BДНК-иммунизацияфуллерен С60адъювантыиммунный ответГосударственный бюджетThe state budgetDustin L.B. Innate and adaptive immune responses in chronic HCV infection. Curr. Drug Targets. 2017; 18(7): 826–43. https://doi.org/10.2174/1389450116666150825110532.Pawlotsky J.M. Hepatitis C virus: standard-of-care treatment. Adv. Pharmacol. 2013; 67: 169–215. https://doi.org/10.1016/B978-0-12-405880-4.00005-6Spearman C.W., Dusheiko G.M., Hellard M., Sonderup M. Hepatitis C. Lancet. 2019; 394(10207): 1451–66. https://doi.org/10.1016/S0140-6736(19)32320-7Osuch S., Metzner K.J., Caraballo Cortes K. Reversal of T cell exhaustion in chronic HCV infection. Viruses. 2020; 12(8): 799. https://doi.org/10.3390/v12080799Telatin V., Nicoli F., Frasson C., Menegotto N., Barbaro F., Castelli E., et al. In chronic hepatitis C infection, myeloid-derived suppressor cell accumulation and T cell dysfunctions revert partially and late after successful direct-acting antiviral treatment. Front. Cell. Infect. Microbiol. 2019; 9: 190. https://doi.org/10.3389/fcimb.2019.00190Elmasry S., Wadhwa S., Bang B.R., Cook L., Chopra S., Kanel G., et al. Detection of occult hepatitis C virus infection in patients who achieved a sustained virologic response to direct-acting antiviral agents for recurrent infection after liver transplantation. Gastroenterology. 2017; 152(3): 550-53.e8. https://doi.org/10.1053/j.gastro.2016.11.002Wang Y., Rao H., Chi X., Li B., Liu H., Wu L., et al. Detection of residual HCV-RNA in patients who have achieved sustained virological response is associated with persistent histological abnormality. EBioMedicine. 2019; 46: 227–35. https://doi.org/10.1016/j.ebiom.2019.07.043Holmes J.A., Yu M.L., Chung R.T. Hepatitis B reactivation during or after direct acting antiviral therapy – implication for susceptible individuals. Expert Opin. Drug Saf. 2017; 16(6): 651–72. https://doi.org/10.1080/14740338.2017.1325869Ghweil A.A., Helal M.M. Reactivation of herpesvirus in patients with hepatitis C treated with direct-acting antiviral agents. Infect. Drug Resist. 2019; 12: 759–62. https://doi.org/10.2147/IDR.S184598Verma R., Khanna P., Chawla S. Hepatitis C vaccine. Need of the hour. Hum. Vacc. Immunother. 2014; 10(7): 1927–9. https://doi.org/10.4161/hv.29033Bailey J.R., Barnes E., Cox A.L. Approaches, progress, and challenges to hepatitis C vaccine development. Gastroenterology. 2019; 156(2): 418–30. https://doi.org/10.1053/j.gastro.2018.08.060Ploss A., Kapoor A. Animal models of hepatitis C virus infection. Cold Spring Harb. Perspect. Med. 2020; 10(5): a036970. https://doi.org/10.1101/cshperspect.a036970Ahlén G., Frelin L. Methods to evaluate novel hepatitis C virus vaccines. Methods Mol. Biol. 2016; 1403: 221–44. https://doi.org/10.1007/978-1-4939-3387-7_11Andrianov A.K., Fuerst T.R. Immunopotentiating and delivery systems for HCV vaccines. Viruses. 2021; 13(6): 981. https://doi.org/10.3390/v13060981.Sepulveda-Crespo D., Resino S., Martinez I. Innate immune response against hepatitis C virus: targets for vaccine adjuvants. Vaccines (Basel). 2020; 8(2): 313. https://doi.org/10.3390/vaccines8020313Gaur M., Misra C., Yadav A.B., Swaroop S., Maolmhuaidh F.O., Bechelany M., et al. Biomedical applications of carbon nanomaterials: fullerenes, quantum dots, nanotubes, nanofibers, and graphene. Materials (Basel). 2021; 14(20): 5978. https://doi.org/10.3390/ma14205978Barzegar A., Naghizadeh E., Zakariazadeh M., Azamat J. Molecular dynamics simulation study of the HIV-1 protease inhibit ion using fullerene and new fullerene derivatives of carbon nanostructures. Mini Rev. Med. Chem. 2017; 17(7): 633–47. https://doi.org/10.2174/1389557516666160609080157Barzegar A., Naghizadeh E., Zakariazadeh M., Azamat J. Molecular dynamics simulation study of the HIV-1 protease inhibit ion using fullerene and new fullerene derivatives of carbon nanostructures. Mini Rev. Med. Chem. 2017; 17(7): 633–47. https://doi.org/10.2174/ 1389557516666160609080157Hurmach V., Platonov M., Prylutska S., Klestova Z., Cherepanov V., Prylutskyy Y., et al. Anticoronavirus activity of water-soluble pristine C60 fullerenes: in vitro and in silico screenings. Adv. Exp. Med. Biol. 2021; 1352: 159–72. https://doi.org/10.1007/978-3-030-85109-5_10.Klimova R., Andreev S., Momotyuk E., Demidova N., Fedorova N., Chernoryzh Y., et al. Aqueous fullerene C60 solution suppresses herpes simplex virus and cytomegalovirus infections. Fuller. Nanotub. Carbon Nanostructures. 2019; 28(6): 487–99. https://doi.org/10.1080/1536383x.2019.1706495Reina G., Peng S., Jacquemin L., Andrade A.F., Bianco A. Hard nanomaterials in time of viral pandemics. ACS nano. 2020; 14(8): 9364–88. https://doi.org/10.1021/acsnano.0c04117Shershakova N., Baraboshkina E., Andreev S., Purgina D., Struchkova I., Kamyshnikov O., et al. Anti-inflammatory effect of fullerene C60 in a mice model of atopic dermatitis. J. Nanobiotechnology. 2016; 14: 8. https://doi.org/10.1186/s12951-016-0159-zKuznietsova H., Dziubenko N., Hurmach V., Chereschuk I., Motuziuk O., Ogloblya O., et al. Water-soluble pristine C60 fullerenes inhibit liver fibrotic alteration and prevent liver cirrhosis in rats. Oxid. Med. Cell. Longev. 2020; 2020: 8061246. https://doi.org/10.1155/2020/8061246Liu J., Feng X., Chen Z., Yang X., Shen Z., Guo M., et al. The adjuvant effect of C60(OH)22 nanoparticles promoting both humoral and cellular immune responses to HCV recombinant proteins. Mater. Sci. Eng. C Mater. Biol. Appl. 2019; 97: 753–9. https://doi.org/10.1016/j.msec.2018.12.088Xu L., Liu Y., Chen Z., Li W., Liu Y., Wang L., et al. Morphologically virus-like fullerenol nanoparticles act as the dual-functional nanoadjuvant for HIV-1 vaccine. Adv. Mater. 2013; 25: 5928–36. https://doi.org/10.1002/adma.201300583Andreev S., Purgina D., Bashkatova E., Garshev A., Maerle A., Andreev I., et al. Study of fullerene aqueous dispersion prepared by novel dialysis method: simple way to fullerene aqueous solution. Fuller. Nanotub. Carbon Nanostructures. 2015; 23(9): 792–800. https://doi.org/10.1080/1536383x.2014.998758Shershakova N.N., Andreev S.M., Tomchuk A.A., Makarova E.A., Nikonova A.A., Turetskiy E.A., et al. Wound healing activity of aqueous dispersion of fullerene C60 produced by “green technology”. Nanomedicine. 2023; 47: 102619. https://doi.org/10.1016/j.nano.2022.102619Ivanov A.V., Korovina A.N., Tunitskaya V.L., Kostyuk D.A., Rechinsky V.O., Kukhanova M.K., et al. Development of the system ensuring a high-level expression of hepatitis C virus nonstructural NS5B and NS5A proteins. Protein Expr. Purif. 2006; 48(1): 14–23. https://doi.org/10.1016/j.pep.2006.02.011Himoudi N., Abraham J.D., Fournillier A., Lone Y.C., Joubert A., Op De Beeck A., et al. Comparative vaccine studies in HLA-A2.1-transgenic mice reveal a clustered organization of epitopes presented in hepatitis C virus natural infection. J. Virol. 2002; 76(24): 12735–46. https://doi.org/10.1128/jvi.76.24.12735-12746.2002Ikram A., Zaheer T., Awan F.M., Obaid A., Naz A., Hanif R., et al. Exploring NS3/4A, NS5A and NS5B proteins to design conserved subunit multi-epitope vaccine against HCV utilizing immunoinformatics approaches. Sci. Rep. 2018; 8(1): 16107. https://doi.org/10.1038/s41598-018-34254-5.Nitschke K., Barriga A., Schmidt J., Timm J., Viazov S., Kuntzen T., et al. HLA-B*27 subtype specificity determines targeting and viral evolution of a hepatitis C virus-specific CD8+ T cell epitope. J. Hepatol. 2014; 60(1): 22–9. https://doi.org/10.1016/j.jhep.2013.08.009.Tan A.C., Eriksson E.M., Kedzierska K., Deliyannis G., Valkenburg S.A., Zeng W., et al. Polyfunctional CD8(+) T cells are associated with the vaccination-induced control of a novel recombinant influenza virus expressing an HCV epitope. Antiviral Res. 2012; 94(2): 168–78. https://doi.org/10.1016/j.antiviral.2012.03.009Vertuani S., Bazzaro M., Gualandi G., Micheletti F., Marastoni M., Fortini C., et al. Effect of interferon-alpha therapy on epitope-specific cytotoxic T lymphocyte responses in hepatitis C virus-infected individuals. Eur. J. Immunol. 2002; 32(1): 144–54. https://doi.org/10.1002/1521-4141(200201)32:1<144::AID-IMMU144>3.0.CO;2-X.Masalova O.V., Lesnova E.I., Ivanov A.V., Pichugin A.V., Permyakova K.Yu., Smirnova O.A., et al. Comparative analysis of the immune response to DNA constructions encoding hepatitis C virus nonstructural proteins. Voprosy virusologii. 2013; 58(2): 21–8. (in Russian)Масалова О.В., Леснова Е.И., Иванов А.В., Пичугин А.В., Пермякова К.Ю., Смирнова О.А. и др. Сравнительный анализ иммунного ответа на ДНК-конструкции, кодирующие неструктурные белки вируса гепатита С. Вопросы вирусологии. 2013; 58(2): 21–8.Ivanov A.V., Smirnova O.A., Ivanova O.N., Masalova O.V., Kochetkov S.N., Isaguliants M.G. Hepatitis C virus proteins activate NRF2/ARE pathway by distinct ROS-dependent and independent mechanisms in HUH7 cells. PLoS One. 2011; 6(9): e24957. https://doi.org/10.1371/journal.pone.0024957Rao X., Hoof I., van Baarle D., Kesmir C., Textor J. HLA preferences for conserved epitopes: a potential mechanism for hepatitis C clearance. Front. Immunol. 2015; 6: 552. https://doi.org/10.3389/fimmu.2015.00552Masalova O.V., Shepelev A.V., Atanadze S.N., Parnes Z.N., Romanova V.S., Vol’pina O.M., et al. Immunostimulating effect of water-soluble fullerene derivatives--perspective adjuvants for a new generation of vaccine. Doklady RAN. 1999; 369(3): 411–3. (in Russian)Масалова О.В., Шепелев А.В., Атанадзе С.Н., Парнес З.Н., Романова В.С., Вольпина О.М. и др. Иммуностимулирующее действие водорастворимых производных фуллерена – перспективных адъювантов для вакцин нового поколения. Доклады РАН. 1999; 369(3): 411–3.Shershakova N.N., Baraboshkina E.N., Andreev S.M., Shabanova D.D., Smirnov V.V., Kamyshnikov O.Yu., et al. Fullerene C60 aqueous solution does not show acute toxicity. Immunologiya. 2016; 37(6): 325–9. https://doi.org/10.18821/0206-4952-2016-37-6-325-329 (in Russian)Шершакова Н.Н., Барабошкина Е.Н., Андреев С.М., Шабанова Д.Д., Смирнов В.В., Камышников О.Ю. и др. Отсутствие острой токсичности у водного раствора фуллерена С60. Immunologiya. 2016; 37(6): 325–9. https://doi.org/10.18821/0206-4952-2016-37-6-325-329Funakoshi-Tago M., Miyagawa Y., Ueda F., Mashino T., Moriwaki Y., Tago K., et al. A bis-malonic acid fullerene derivative significantly suppressed IL-33-induced IL-6 expression by inhibiting NF-kappaB activation. Int. Immunopharmacol. 2016; 40: 254–64. https://doi.org/10.1016/j.intimp.2016.08.031Bashkatova E.N., Andreev S.M., Shershakova N.N., Babakhin A.A., Shilovskiy I.P., Khaitov M.R. Study of modulating effects of fullerene [C60] adducts on the reaction of delayed-type hypersensitivity. Fiziologiya i patologiya immunnoy sistemy. 2012; 16(2): 17–27. (in Russian)Башкатова Е.Н., Андреев С.М., Шершакова Н.Н., Бабахин А.А., Шиловский И.П., Хаитов М.Р. Изучение модулирующей активности производных фуллерена С60 на реакцию гиперчувствительности замедленного типа. Физиология и патология иммунной системы. 2012; 16(2): 17–27.Yamashita K., Sakai M., Takemoto N., Tsukimoto M., Uchida K., Yajima H., et al. Attenuation of delayed-type hypersensitivity by fullerene treatment. Toxicology. 2009; 261(1-2): 19–24. https://doi.org/10.1016/j.tox.2009.04.034