Problems of VirologyProblems of VirologyВопросы вирусологии0507-40882411-2097Central Research Institute for Epidemiology47910.36233/0507-4088-30ORIGINAL RESEARCHESОРИГИНАЛЬНЫЕ ИССЛЕДОВАНИЯReal-time PCR assay development for the control of vaccine against hemorrhagic fever with renal syndromeРазработка метода количественного определения вирусной РНК для контроля специфической активности вакцины против геморрагической лихорадки с почечным синдромомhttps://orcid.org/0000-0002-6416-2573EgorovaM. S.ЕгороваМ. С.
Russian Federation

Maria S. Egorova - Ph.D. (Biol.), Senior Researcher of the Laboratory of Hemorrhagic Fevers.

108819, Moscow

Егорова Мария Сергеевна - кандидат биологических наук, старший научный сотрудник лаборатории геморрагических лихорадок.

108819, Москва

masha_0787@mail.ruhttps://orcid.org/0000-0001-9934-699XKurashovaS. S.КурашоваС. С.
Russian Federation

Kurashova Svetlana Sergeevna - Researcher, Laboratory of Hemorrhagic Fevers.

108819, Moscow

Курашова Светлана Сергеевна - научный сотрудник лаборатории геморрагических лихорадок ФГБНУ ФНЦИРИП им. М. П. Чумакова РАН.

108819, Москва

svetlanak886@yandex.ruhttps://orcid.org/0000-0001-6130-4145IshmukhametovA. A.ИшмухаметовА. А.
Russian Federation

Ishmukhametov Aidar Airatovich - PhD, MD,  Professor, Corresponding Member of the Russian Academy of Sciences.

108819, Moscow, 119991, Moscow

 

Ишмухаметов Айдар Айратович - доктор медицинских наук, профессор, член - корреспондент РАН, генеральный директор ФГБНУ ФНЦИРИП им. М. П. Чумакова РАН.

108819, 119991, Москва

aishmukhametov@gmail.comhttps://orcid.org/0000-0003-2198-7521BalovnevaM. V.БаловневаМ. В.
Russian Federation

Balovneva Maria Vladimirovna - PhD, Leading Researcher, Laboratory of Hemorrhagic Fevers.

108819, Moscow

Баловнева Мария Владимировна - ведущий научный сотрудник лаборатории геморрагических лихорадок ФГБНУ ФНЦИРИП им. М. П. Чумакова РАН.

119991, Москва

mashasm@yandex.ruhttps://orcid.org/0000-0003-0789-4601DeviatkinA. A.ДевяткинА. А.
Russian Federation

Devyatkin Andrey Andreevich - PhD, Leading Researcher, Laboratory of Molecular Biology and Biochemistry, Institute of Molecular Medicine.

119991, Moscow

Девяткин Андрей Андреевич - кандидат биологических наук, старший научный сотрудник лаборатории молекулярной биологии и биохимии.

119991, Москваandreideviatkin@gmail.comhttps://orcid.org/0000-0002-5579-5694SafonovaM. V.СафоноваМ. В.
Russian Federation

Safonova Marina Viktorovna - Researcher, laboratory for viral infections I-II pathogenicity groups diagnostics of the Federal Public Health Institution "Anti-Plague Center".

119121, Moscow

Сафонова Марина Викторовна - биолог лаборатории диагностики вирусных инфекций I-II групп патогенности.

119121, Москва

Marina-iris@mail.ruhttps://orcid.org/0000-0001-9778-0485OzherelkovS. V.ОжерелковС. В.
Russian Federation

Ozherelkov Sergey Viktorovich – PhD, DSc, Leading Researcher, tick-borne encephalitis and other viral encephalitis laboratory.

108819, Moscow

Ожерелков Сергей Викторович - доктор биологических наук, ведущий научный сотрудник лаборатории клещевого энцефалита и других вирусных энцефалитов ФГБНУ ФНЦИРИП им. М. П. Чумакова РАН.

108819, Москва

ozherelkov@yandex.ruhttps://orcid.org/0000-0003-1613-5228KhapchaevYu. Kh.ХапчаевЮ. Х.
Russian Federation

Khapchaev Yusuf Khadzhibekovich - PhD, DSc, Head of the Polio Vaccine Department.

108819, Moscow

Хапчаев Юсуф Хаджибекович - доктор биологических наук, начальник отделения полиомиелитной вакциныФГБНУ ФНЦИРИП им. М. П. Чумакова РАН.

108819, Москва

hapchaev_uh@chumakovs.suhttps://orcid.org/0000-0002-9704-7774BalkinaA. S.БалкинаА. С.
Russian Federation

Balkina Alexandra Sergeevna - Researcher, Laboratory of Hemorrhagic Fevers.

108819, Moscow

Балкина Александра Сергеевна - научный сотрудник лаборатории геморрагических лихорадок ФГБНУ ФНЦИРИП им. М. П. Чумакова РАН.

108819, Москва

balkina_as@chumakovs.suBelyakovaA. V.БеляковаА. В.
Russian Federation

Belyakova Alla Vladimirovna - PhD, Scientific Secretary.

108819, Moscow

Белякова Алла Владимировна - кандидат биологических наук, учёный секретарьФГБНУ ФНЦИРИП им. М. П. Чумакова РАН.

108819, Москва

belyakova_av@chumakovs.suhttps://orcid.org/0000-0002-6656-1682DzagurovaT. K.ДзагуроваТ. К.
Russian Federation

Dzagurova Tamara Kazbekovna - PhD, MD,  Leading Researcher, Head of the Laboratory of Hemorrhagic Fevers.

108819, Moscow

Дзагурова Тамара Казбековна - доктор медицинских наук, ведущий научный сотрудник, руководитель Лаборатории геморрагических лихорадок ФГБНУ ФНЦИРИП им. М. П. Чумакова РАН.

108819, Москва

centrglps@yandex.ruhttps://orcid.org/0000-0002-6829-1241TkachenkoE A.ТкаченкоЕ. А.
Russian Federation

Tkachenko Evgeniy Aleksandrovich - PhD, MD, Professor, Scientific Superviser.

108819, Moscow

Ткаченко Евгений Александрович - доктор медицинских наук, профессор, Руководитель научного направления ФГБНУ ФНЦИРИП им. М. П. Чумакова РАН.

108819, Москва

evgeniytkach@mail.ruFSBSI M.I. Chumakov Federal Scientific Center for Research and Development of Immune-and-Biological Products of Russian Academy of SciencesФГБНУ Федеральный научный центр исследований и разработки иммунобиологических препаратов им. М.П. Чумакова, РАНInstitute for Translational Medicine and Biotechnology, FSAEI HE I.M. Sechenov First Moscow State Medical University of the Ministry of the Health of RussiaИнститут трансляционной медицины и биотехнологии, ФГАОУ ВО Первый Московский государственный университет им. И.М. Сеченова Минздрава РоссииInstitute of Molecular Medicine, FSAEI HE I.M. Sechenov First Moscow State Medical University of the Ministry of the Health of RussiaИнститут молекулярной медицины, ФГАОУ ВО Первый Московский государственный университет им. И.М. Сеченова Минздрава РоссииFSHI Plague Control Center» of the Federal Service for Surveillance of Consumer Rights Protection and Human Wellbeing (Rospotrebnadzor)ФКУЗ Противочумный центр Федеральной службы по надзору в сфере защиты прав потребителей и благополучия человека (Роспотребнадзор)0703202166165730703202107032021Copyright ©; 2021, Egorova M.S., Kurashova S.S., Ishmukhametov A.A., Balovneva M.V., Deviatkin A.A., Safonova M.V., Ozherelkov S.V., Khapchaev Y.K., Balkina A.S., Belyakova A.V., Dzagurova T.K., Tkachenko E.A.Copyright ©; 2021, Егорова М.С., Курашова С.С., Ишмухаметов А.А., Баловнева М.В., Девяткин А.А., Сафонова М.В., Ожерелков С.В., Хапчаев Ю.Х., Балкина А.С., Белякова А.В., Дзагурова Т.К., Ткаченко Е.А.2021Egorova M.S., Kurashova S.S., Ishmukhametov A.A., Balovneva M.V., Deviatkin A.A., Safonova M.V., Ozherelkov S.V., Khapchaev Y.K., Balkina A.S., Belyakova A.V., Dzagurova T.K., Tkachenko E.A.Егорова М.С., Курашова С.С., Ишмухаметов А.А., Баловнева М.В., Девяткин А.А., Сафонова М.В., Ожерелков С.В., Хапчаев Ю.Х., Балкина А.С., Белякова А.В., Дзагурова Т.К., Ткаченко Е.А.https://creativecommons.org/licenses/by/4.0https://virusjour.crie.ru/jour/article/view/479

Introduction. Hemorrhagic fever with renal syndrome (HFRS) holds a leading place among natural focal human diseases in Russian Federation. There is no etiotropic therapy for the disease now. The vaccine prophylaxis is the most effective method to control this infection. The main criteria for inactivated vaccines evaluation are its immunogenicity and specific activity.

The study purposes were to develop a sensitive and specific real-time PCR method for viral RNA quantification in the inactivated vaccine and to study the correlation between the viral RNA amount and vaccine immunogenicity.

Material and methods. L-segment fragments of the Puumala, Hantaan, and Sochi vaccine strains were selected as diagnostic targets for oligonucleotides and fluorescent probes. The immunogenicity of experimental vaccines was determined by the induction of neutralizing antibodies in BALB/c mice.

Results. A highly specific, sensitive and reproducible real-time PCR method has been developed. The analytical sensitivity was 1.24 ± 1.5 x 102 copies/ml for Puumala virus; 1.16 ± 1.4 * 102 copies/ml for Hantaan; 1.32 ± 1.8 * 102 copies/ ml for Sochi, with a virus content of 1.5 ± 0.5 lg FFU/ml; 1.8 ± 0.5 lg FFU/ml and 2.2 ± 0.5 lg FFU/ml, respectively. The viral RNA amount in experimental vaccine preparations inactivated with β-propiolactone was proportional to the neutralizing antibodies titer observed in mice following the immunization.

Discussion. It was found that different virus inactivators differently affects the detected viral RNA amount, but not the vaccine immunogenicity, which indicates the same degree of the immunogenic proteins damage. The direct relationship between the viral RNA copy number and vaccine immunogenicity makes it possible to use this criterion for vaccine dosage preparation.

Conclusion. The developed method for viral RNA quantification is a promising tool for the specific activity control of the HFRS vaccine.

Введение. Геморрагическая лихорадка с почечным синдромом (ГЛПС) занимает ведущее место среди природно-очаговых болезней человека в Российской Федерации. Этиотропная терапия заболевания в настоящее время отсутствует. Наиболее действенным методом контроля этой инфекции может стать вакцинопрофилактика. Основными критериями оценки инактивированной вакцины являются её иммуногенность и специфическая активность.

Цель исследования - разработка чувствительной и специфичной методики проведения ПЦР в реальном времени с целью количественного определения вирусной РНК в инактивированной вакцине, а также установление корреляции между содержанием генетического материала вируса и выраженностью иммуногенности. Материал и методы. В качестве диагностической мишени для олигонуклеотидов и флуоресцентных зондов выбраны фрагменты L-сегмента вакцинных штаммов вирусов ГЛПС Пуумала, Хантаан, Сочи. Иммуногенность экспериментальных вакцин контролировали по индукции нейтрализующих антител (нАТ) в ответ на иммунизацию мышей линии BALB/c.

Результаты. Разработана высокоспецифичная, чувствительная методика проведения ПЦР в реальном времени, имеющая высокий показатель воспроизводимости. Аналитическая чувствительность составила для вирусов Пуумала 1,24 ± 1,5 х 102 копий/мл, Хантаан - 1,16 ± 1,4 х 102 копий/мл, Сочи - 1,32 ± 1,8 х 102 копий/мл при содержании вируса 1,5 ± 0,5, 1,8 ± 0,5 и 2,2 ± 0,5 lg ФОЕ/мл соответственно. Показано, что количество вирусной РНК в составе экспериментальных вакцинных препаратов, инактивированных β-про-пиолактоном (β-ПЛ), пропорционально титру нАТ в ответ на иммунизацию.

Обсуждение. Установлено, что способ инактивирования вируса влияет на выявляемое количество копий РНК, не оказывая при этом воздействия на иммуногенность, что указывает на равнозначное повреждение белков-иммуногенов при разной степени повреждения вирусной РНК. Прямая зависимость между содержанием копий нуклеиновой кислоты вируса и иммуногенностью позволяет использовать этот критерий для дозирования вакцинного препарата.

Заключение. Разработанная система оценки количественного содержания вирусной РНК делает перспективным её применение для контроля специфической активности вакцины против ГЛПС.

hemorrhagic fever with renal syndrome (HFRS)inactivated vaccinereal-time quantitative polymerase chain reaction (qRT-PCR)formalinβ-propiolactone (β-PL)ultravioletгеморрагическая лихорадка с почечным синдромоминактивированная вакцинаполимеразная цепная реакция в реальном времени (ПЦР-РВ)формалинβ-пропиолактон (β-ПЛ)ультрафиолетThe study was performed under the topic of Government Order No. 0837-2019-0006Исследование выполнено по теме Госзадания № 0837-2019-00061. Kruger D.H., Figueiredo L.T., Song J.W., Klempa B. Hantaviruses -globally emerging pathogens. J. Clin. Virol. 2014; 64: 128-36. https://doi.org/10.1016/jjcv.2014.08.033.2. Lahdevirta J. Nephropathia epidemica in Finland. A clinical, histological and epidemiological study. Ann. Clin. Res. 1971; 3(Suppl. 8): 1-154.3. Schmaljohn C., Hjelle B. Hantaviruses: a global disease problem. Emerg. Infect. Dis. 1997; 3(2): 95-104. https://doi.org/10.3201/eid0302.970202.4. Maes P., Li S., Verbeeck J., Keyaerts E., Clement J., Van Ranst M. Evaluation of the efficacy of disinfectants against Puumala hantavirus by real-time RT-PCR. J. Virol. Methods. 2007; 141(1): 111-5. https://doi.org/10.1016/jjviromet.2006.11.037.5. Plyusnin A., Vapalahti O., Vaheri A. Hantaviruses: genome structure, expression and evolution. J. Gen. Virol. 1996; 77(Pt. 11): 2677-87. https://doi.org/10.1099/0022-1317-77-11-2677.6. Schmaljohn C.S., Dalrymple J.M. Analysis of Hantaan virus RNA: evidence for a new genus of Bunyaviridae. Virology. 1983; 131(2): 482-91. https://doi.org/10.1016/0042-6822(83)90514-7.7. Tkachenko E.A., Ishmukhametov A.A., Dzagurova T.K., Bern-shtein A.D., Morozov V.G., Sinyugina A.A., et al. Hemorrhagic fever with renal syndrome, Russia. Emerg. Infect. Dis. 2019; 25(12): 2325-8. https://doi.org/10.3201/eid2512.181649.8. Liu R., Ma H., Shu J., Zhang Q., Han M., Liu Z., et al. Vaccines and therapeutics against hantaviruses. Front. Microbiol. 2019; 10: 2989. https://doi.org/10.3389/fmicb.2019.02989.9. Бархалева О.А., Воробьева М.С., Ладыженская И.П., Ткаченко Е.А., Дзагурова Т.К. Вакцина против геморрагической лихорадки с почечным синдромом. БИОпрепараты. Профилактика, диагностика, лечение. 2011; (1): 27-30.10. Jiang W., Ma N., Hui Q., Chen B., Qiu Y., Sun H., et al. Type inactivated bivalent hantavirus vaccines using dual fluorescence quantitative real time PCR: Establishment and evaluation. J. Med. Virol. 2017; 89(1): 10-6. https://doi.org/10.1002/jmv.24599.11. Ткаченко Е.А., Ишмухаметов А.А., Дзагурова Т.К., Синюгина А.А., Коротина Н.А., Набатников П.А., и др. Разработка экспериментально-промышленной технологии производства вакцины для профилактики геморрагической лихорадки с почечным синдромом. Ремедиум. Журнал о российском рынке лекарств и медицинской технике. 2015; (6): 47-53.12. Курашова С.С., Ишмухаметов А.А., Егорова MG., Баловнева М.В., Дзагурова Т.К., Ткаченко Е.А. Сравнительная характеристика инактивирующих агентов для создания вакцины против геморрагической лихорадки с почечным синдромом. Эпидемиология и вакцинопрофилактика. 2018; 17(4): 26-8. https://doi.org/10.31631/2073-3046-2018-17-4-26-29.13. Епринцев А.Т., Попов В.Н., Федорин Д.Н. Идентификация и исследование экспрессии генов: Учебно-методическое пособие для вузов. Воронеж; 2008: 14-5.14. Дзагурова Т.К., Солопова О.Н., Свешников П.Г., Коротина Н.А., Баловнева М.В., Леонович О.А., и др. Разработка иммуноферментной тест-системы на основе моноклональных антител для определения специфической активности вакцины против геморрагической лихорадки с почечным синдромом. Вопросы вирусологии. 2013; 58(1): 40-4.15. Дзагурова Т.К., Ткаченко Е.А., Башкирцев В.Н., Окулова Н.М., Апекина Н.С., Коротина Н.А., и др. Выделение и идентификация штаммов хантавирусов - возбудителей ГЛПС в Европейской части России.Медицинская вирусология. 2008; 25: 142-50.