Problems of VirologyProblems of VirologyВопросы вирусологии0507-40882411-2097Central Research Institute for Epidemiology1687110.36233/0507-4088-377pcbgmiORIGINAL RESEARCHESОРИГИНАЛЬНЫЕ ИССЛЕДОВАНИЯResearch ArticleCharacterization of neutralizing epitopes of the respiratory syncytial virus (Pneumoviridae: Orthopneumovirus: Orthopneumovirus hominis) F protein using a panel of monoclonal antibodies and escape mutantsХарактеристика нейтрализующих эпитопов F-белка респираторно-синцитиального вируса (Pneumoviridae: Orthopneumovirus: Orthopneumovirus hominis) с использованием панели моноклональных антител и эскейп-мутантовhttps://orcid.org/0000-0002-9146-0816KryvitskayaVera Z.КривицкаяВера Зорьевна
Russian Federation

D.B.Sc., Leading Researcher, Laboratory of Risk Factors for Influenza and Acute Respiratory Viral Infections, Department of Etiology and Epidemiology

д-р биол. наук, ведущий научный сотрудник лаборатории факторов риска при гриппе и ОРВИ отдела этиологии и эпидемиологии

vera.krivitskaya@influenza.spb.ruhttps://orcid.org/0000-0003-2258-4679PetrovaEkaterina R.ПетроваЕкатерина Романовна
Russian Federation

Researcher, Laboratory of Risk Factors for Influenza and Acute Respiratory Viral Infections, Department of Etiology and Epidemiology

научный сотрудник лаборатории факторов риска при гриппе и ОРВИ отдела этиологии и эпидемиологии

ekaterina.petrova@influenza.spb.ruhttps://orcid.org/0000-0003-1732-1727SorokinEvgeniy V.СорокинЕвгений Валентинович
Russian Federation

PhD, Head of the Laboratory of Biotechnology of Diagnostic Products, Department of Biotechnology

канд. биол. наук, заведующий лабораторией биотехнологии диагностических препаратов отдела биотехнологий

evgeniy.sorokin@influenza.spb.ruhttps://orcid.org/0000-0003-4757-0521TsarevaTatyana R.ЦареваТатьяна Радистовна
Russian Federation

Senior Researcher, Laboratory of Biotechnology of Diagnostic Products, Department of Biotechnology

старший научный сотрудник лаборатории биотехнологии диагностических препаратов отдела биотехнологий

tatyana.tsareva@influenza.spb.ruhttps://orcid.org/0000-0002-1465-5548KomissarovaKsenia S.КомиссароваКсения Сергеевна
Russian Federation

Researcher, Laboratory of Molecular Virology, Department of Etiology and Epidemiology

научный сотрудник лаборатории молекулярной вирусологии отдела этиологии и эпидемиологии

kseniya.komissarova@influenza.spb.ruhttps://orcid.org/0000-0002-1015-595XSomininaAnna A.СомининаАнна Адольфовна
Russian Federation

D.B.Sc., Head of Laboratory, Chief Researcher, Laboratory of Risk Factors for Influenza and Acute Respiratory Viral Infections, Department of Etiology and Epidemiology

д-р биол. наук, заведующая лабораторией, главный научный сотрудник лаборатории факторов риска при гриппе и ОРВИ отдела этиологии и эпидемиологии

anna.sominina@influenza.spb.ruhttps://orcid.org/0000-0001-6174-0836DanilenkoDaria M.ДаниленкоДарья Михайловна
Russian Federation

PhD, Head of the Department of Etiology and Epidemiology, Leading Researcher, Laboratory of Etiology of Viral Infections, Deputy Director for Research

канд. биол. наук, заведующая отделом этиологии и эпидемиологии, ведущий научный сотрудник лаборатории этиологии вирусных инфекций, заместитель директора по научной работе

daria.danilenko@influenza.spb.ruSmorodintsev Research Institute of Influenza, Ministry of Health of the Russian FederationФГБУ «Научно-исследовательский институт гриппа им. А.А. Смородинцева» Минздрава России3006202671327228327032026Copyright ©; 2026, Kryvitskaya V.Z., Petrova E.R., Sorokin E.V., Tsareva T.R., Komissarova K.S., Sominina A.A., Danilenko D.M.Copyright ©; 2026, Кривицкая В.З., Петрова Е.Р., Сорокин Е.В., Царева Т.Р., Комиссарова К.С., Соминина А.А., Даниленко Д.М.2026Kryvitskaya V.Z., Petrova E.R., Sorokin E.V., Tsareva T.R., Komissarova K.S., Sominina A.A., Danilenko D.M.Кривицкая В.З., Петрова Е.Р., Сорокин Е.В., Царева Т.Р., Комиссарова К.С., Соминина А.А., Даниленко Д.М.https://creativecommons.org/licenses/by/4.0https://virusjour.crie.ru/jour/article/view/16871

The aim of this work was to identify neutralizing epitopes of the F protein of respiratory syncytial virus subtype A (RSV-A) using a panel of monoclonal antibodies (mAbs) with characterized epitope targeting.

Materials and methods. Neutralizing activity was assessed using a microcultural ELISA.

Results. All studied MAbs neutralized the original virus, albeit less potently than palivizumab. Escape mutants (EMs) resistant to neutralization by the corresponding homologous antibody were generated by passaging the virus in the presence of each mAb. For five mAbs (5H8, 7H8, 9E12, 12C9, 5F8), the loss of neutralizing activity was accompanied by a sharp reduction in binding to the EMs (negative selection), whereas for three others (5F3, 7B12, 10G6), binding was largely preserved, indicating conformational changes critical for neutralization function but not for binding to the F protein itself (positive selection). Whole-genome sequencing revealed multiple substitutions in the EMs affecting not only the F protein (N276S in antigenic site II and R190S in site V) but also other viral proteins (G, L, N, P, M, M2-2).

Conclusion. Based on competitive ELISA data and sequencing results, we propose the identification of two spatially adjacent neutralizing antigenic sites (A and B) on the F protein.

Целью настоящей работы являлась идентификация нейтрализующих эпитопов F-белка респираторно-синцитиального вируса (РСВ) субтипа А (РСВ-А) с использованием панели моноклональных антител (МКА) с охарактеризованной эпитопной направленностью.

Материалы и методы. Проводили оценку нейтрализующей активности МКА с использованием микрокультурального иммуноферментного анализа (ИФА).

Результаты. Все исследованные МКА нейтрализовали исходный вирус, хотя и слабее паливизумаба. Путем пассирования вируса в присутствии каждого МКА были получены эскейп-мутанты (ЭМ), устойчивые к нейтрализации соответствующим «гомологичным» антителом. Установлено, что для 5 МКА (5H8, 7H8, 9E12, 12C9, 5F8) потеря нейтрализующей активности сопровождалась резким снижением связывания с ЭМ (негативная селекция), тогда как для 3 других (5F3, 7B12, 10G6) связывание почти не нарушалось, что указывало на конформационные изменения, критичные для функции нейтрализации, но не для самого связывания с F-белком (позитивная селекция). Полногеномное секвенирование выявило в ЭМ множественные замены, затрагивающие не только F-белок (N276S в антигенном сайте II и R190S в сайте V), но и другие вирусные белки (G, L, N, P, M, M2-2).

Заключение. На основании данных конкурентного ИФА и результатов секвенирования предложено выделение двух пространственно-сближенных нейтрализующих антигенных сайтов (А и В) на F-белке.

respiratory syncytial virusF proteinescape mutantsmonoclonal antibodiesantigenic sitesреспираторно-синцитиальный вирусF-белокэскейп-мутантымоноклональные антителаантигенные сайтыMinistry of Health of the Russian FederationМинистерство здравоохранения Российской Федерации125020501529-4The study was supported by the State Assignment of the Ministry of Health of the Russian Federation "Genetic and antigenic determinants of variability of modern human pneumoviruses circulating in the Russian Federation" (State Registration No. 125020501529-4)Исследование выполнено за счет средств государственного задания Минздрава России «Генетические и антигенные детерминанты изменчивости современных пневмовирусов человека, циркулирующих на территории Российской Федерации» (рег. № НИОКТР 125020501529-4)Shi T., McAllister D.A., O’Brien K.L., Simoes E.A.F., Madhi S.A., Gessner B.D., et al. Global, regional, and national disease burden estimates of acute lower respiratory infections due to respiratory syncytial virus in young children in 2015: a systematic review and modelling study. Lancet. 2017; 390(10098): 946–58. https://doi.org/10.1016/S0140-6736(17)30938-8 https://elibrary.ru/yhjjahCiapponi A., Palermo M.C., Sandoval M.M., Baumeister E., Ruvinsky S., Ulloa-Gutierrez R., et al. Respiratory syncytial virus disease burden in children and adults from Latin America: a systematic review and meta-analysis. Front. Public Health. 2024; 12: 1377968. https://doi.org/10.3389/fpubh.2024.1377968 https://elibrary.ru/yinrcgGraham B.S. Immunological goals for respiratory syncytial virus vaccine development. Curr. Opin. Immunol. 2019; 59: 57–64. https://doi.org/10.1016/j.coi.2019.03.005Sun M., Lai H., Na F., Li S., Qiu X., Tian J., et al. Monoclonal antibody for the prevention of respiratory syncytial virus in infants and children: a systematic review and network meta-analysis. JAMA Netw. Open. 2023; 6(2): e230023. https://doi.org/10.1001/jamanetworkopen.2023.0023 https://elibrary.ru/bdayfeVos L.M., Oosterheert J.J., Kuil S.D., Viveen M., Bont L.J., Hoepelman A.I.M., et al. High epidemic burden of RSV disease coinciding with genetic alterations causing amino acid substitutions in the RSV G-protein during the 2016/2017 season in the Netherlands. J. Clin. Virol. 2019; 112: 20–6. https://doi.org/10.1016/j.jcv.2019.01.007Lin G.L., Drysdale S.B., Snape M.D., O’Connor D., Brown A., MacIntyre-Cockett G., et al. Distinct patterns of within-host virus populations between two subgroups of human respiratory syncytial virus. Nat. Commun. 2021; 12(1): 5125. https://doi.org/10.1038/s41467-021-25265-4 https://elibrary.ru/ihttizRios Guzman E., Hultquist J.F. Clinical and biological consequences of respiratory syncytial virus genetic diversity. Ther. Adv. Infect. Dis. 2022; 9: 20499361221128091. https://doi.org/10.1177/20499361221128091 https://elibrary.ru/vyytdqElshin N.D., Komissarova K.S., Komissarov A.B., Danilenko D.M., Lioznov D.A. Set of oligonucleotides for genome-wide amplification of respiratory syncytial viruses type A and B. Patent RF № 2811576; 2024. https://elibrary.ru/vwlgre (in Russian)Елшин Н.Д., Комиссарова К.С., Комиссаров А.Б., Даниленко Д.М., Лиознов Д.А. Набор олигонуклеотидов для полногеномной амплификации респираторно-синцитиальных вирусов типов А и В. Патент РФ № 2811576; 2024. https://elibrary.ru/vwlgreKrivitskaya V., Petrova E., Sorokin E., Tsareva T., Sverlova M., Komissarova K., et al. Characterization of a panel of monoclonal antibodies targeting the F-protein of the respiratory syncytial virus (RSV) for the typing of contemporary circulating strains. Trop. Med. Infect. Dis. 2024; 9(1): 1. https://doi.org/10.3390/tropicalmed9010001 https://elibrary.ru/rjtsdaLangedijk A.C., Harding E.R., Konya B., Vrancken B., Lebbink R.J., Evers A., et al. A systematic review on global RSV genetic data: Identification of knowledge gaps. Rev. Med. Virol. 2022; 32(3): e2284. https://doi.org/10.1002/rmv.2284 https://elibrary.ru/skylrwMcLellan J.S., Ray W.C., Peeples M.E. Structure and function of respiratory syncytial virus surface glycoproteins. Curr. Top. Microbiol. Immunol. 2013; 372: 83–104. https://doi.org/10.1007/978-3-642-38919-1_4Musa A.O., Faber S.R., Forrest K., Smith K.P., Sengupta S., López C.B. Identification of distinct genotypes in circulating RSV A strains based on variants in the virus replication-associated genes. J. Virol. 2024; 98(8): e0099024. https://doi.org/10.1128/jvi.00990-24 https://elibrary.ru/gkiivzKimura H., Nagasawa K., Tsukagoshi H., Matsushima Y., Fujita K., Yoshida L.M., et al. Molecular evolution of the fusion protein gene in human respiratory syncytial virus subgroup A. Infect. Genet. Evol. 2016; 43: 398–406. https://doi.org/10.1016/j.meegid.2016.06.019Stobbelaar K., Jacobs L., Serrano-Cano F.I., Fransen A., Van der Gucht W., Smet A., et al. Functional implications of respiratory syncytial virus F sequence variability: a comparative analysis using contemporary RSV isolates. mSphere. 2025; 10(5): e0086024. https://doi.org/10.1128/msphere.00860-24 https://elibrary.ru/yydpweTabor D.E., Fernandes F., Langedijk A.C., Wilkins D., Lebbink R.J., Tovchigrechko A., et al. Global molecular epidemiology of respiratory syncytial virus from the 2017-2018 INFORM-RSV study. J. Clin. Microbiol. 2020; 59(1): e01828-20. https://doi.org/10.1128/JCM.01828-20 https://elibrary.ru/pvcrydAdams O., Bonzel L., Kovacevic A., Mayatepek E., Hoehn T., Vogel M. Palivizumab-resistant human respiratory syncytial virus infection in infancy. Clin. Infect. Dis. 2010; 51(2): 185–8. https://doi.org/10.1086/653534Zhu Q., Patel N.K., McAuliffe J.M., Zhu W., Wachter L., McCarthy M.P., et al. Natural polymorphisms and resistance-associated mutations in the fusion protein of respiratory syncytial virus (RSV): effects on RSV susceptibility to palivizumab. J. Infect. Dis. 2012; 205(4): 635–8. https://doi.org/10.1093/infdis/jir790Singh S.R., Dennis V.A., Carter C.L., Pillai S.R., Moore E.G. Respiratory syncytial virus recombinant F protein (residues 255-278) induces a helper T cell type 1 immune response in mice. Viral Immunol. 2007; 20(2): 261–75. https://doi.org/10.1089/vim.2007.0008Tome L., Frabasile S., Candia C., Pittini A., Farina N., Melero J.A., et al. Selection and characterization of human respiratory syncytial virus escape mutants resistant to a polyclonal antiserum raised against the F protein. Arch. Virol. 2012; 157(6): 1071–80. https://doi.org/10.1007/s00705-012-1274-2 https://elibrary.ru/rcpjolMcLellan J.S., Chen M., Joyce M.G., Sastry M., Stewart-Jones G.B., Yang Y., et al. Structure-based design of a fusion glycoprotein vaccine for respiratory syncytial virus. Science. 2013; 342(6158): 592–8. https://doi.org/10.1126/science.1243283 https://elibrary.ru/spiokjFuentes S., Coyle E.M., Beeler J., Golding H., Khurana S. Antigenic fingerprinting following primary RSV infection in young children identifies novel antigenic sites and reveals unlinked evolution of human antibody repertoires to fusion and attachment glycoproteins. PLoS Pathog. 2016; 12(4): e1005554. https://doi.org/10.1371/journal.ppat.1005554Palomo C., Mas V., Thom M., Vázquez M., Cano O., Terrón M.C., et al. Influence of respiratory syncytial virus F glycoprotein conformation on induction of protective immune responses. J. Virol. 2016; 90(11): 5485–98. https://doi.org/10.1128/JVI.00338-16Palomo C., Mas V., Detalle L., Depla E., Cano O., Vázquez M., et al. Trivalency of a nanobody specific for the human respiratory syncytial virus fusion glycoprotein drastically enhances virus neutralization and impacts escape mutant selection. Antimicrob. Agents Chemother. 2016; 60(11): 6498–509. https://doi.org/10.1128/AAC.00842-16 https://elibrary.ru/vkjgosMelero J.A., Moore M.L. Influence of respiratory syncytial virus strain differences on pathogenesis and immunity. Curr. Top. Microbiol. Immunol. 2013; 372: 59–82. https://doi.org/10.1007/978-3-642-38919-1_3Lee J., Klenow L., Coyle E.M., Golding H., Khurana S. Protective antigenic sites in respiratory syncytial virus G attachment protein outside the central conserved and cysteine noose domains. PLoS Pathog. 2018; 14(8): e1007262. https://doi.org/10.1371/journal.ppat.1007262DTU Health Techl. NetOGlyc-4.0. Available at: https://services.healthtech.dtu.dk/services/NetOGlyc-4.0/DTU Health Techl. NetOGlyc - 4.0. Available at: https://services.healthtech.dtu.dk/services/NetOGlyc-4.0/Ha B., Chirkova T., Boukhvalova M.S., Sun H.Y., Walsh E.E., Anderson C.S., et al. Mutation of respiratory syncytial virus G protein’s CX3C motif attenuates infection in cotton rats and primary human airway epithelial cells. Vaccines. 2019; 7(3): e69. https://doi.org/10.3390/vaccines7030069Cane P.A., Pringle C.R. Evolution of subgroup A respiratory syncytial virus: evidence for progressive accumulation of amino acid changes in the attachment protein. J. Virol. 1995; 69(5): 2918–25. https://doi.org/10.1128/jvi.69.5.2918-2925.1995Cane P. Molecular epidemiology and evolution of RSV. In: Cane P., ed. Respiratory Syncytial Virus. Amsterdam: Elsevier; 2007: 89–113.Sutto-Ortiz P., Eléouët J.F., Ferron F., Decroly E. Biochemistry of the respiratory syncytial virus L protein embedding RNA polymerase and capping activities. Viruses. 2023; 15(2): 341. https://doi.org/10.3390/v15020341 https://elibrary.ru/foaaqmHuong T.N., Lee Z.Q., Lai S.K., Lee H.Y., Tan B.H., Sugrue R.J. Evidence that an interaction between the respiratory syncytial virus F and G proteins at the distal ends of virus filaments mediates efficient multiple cycle infection. Virology. 2024; 591: 109985. https://doi.org/10.1016/j.virol.2024.109985 https://elibrary.ru/nvtukjMcGinnes Cullen L., Luo B., Wen Z., Zhang L., Durr E., Morrison T.G. The Respiratory Syncytial Virus (RSV) G protein enhances the immune responses to the RSV F protein in an enveloped virus-like particle vaccine candidate. J. Virol. 2023; 97(1): e0190022. https://doi.org/10.1128/jvi.01900-22 https://elibrary.ru/ljulvfBlanchard E.L., Braun M.R., Lifland A.W., Ludeke B., Noton S.L., Vanover D., et al. Polymerase-tagged respiratory syncytial virus reveals a dynamic rearrangement of the ribonucleocapsid complex during infection PLoS Pathog. 2020; 16(10): e1008987. https://doi.org/10.1371/journal.ppat.1008987 https://elibrary.ru/eddadaShaikh F.Y., Cox R.G., Lifland A.W., Hotard A.L., Williams J.V., Moore M.L., et al. A critical phenylalanine residue in the respiratory syncytial virus fusion protein cytoplasmic tail mediates assembly of internal viral proteins into viral filaments and particles. mBio. 2012; 3(1): e00270-11. https://doi.org/10.1128/mbio.00270-11