Introduction. The identification of I/II genotype recombinant African swine fever virus (ASFV) in China (2021) and its subsequent introduction to Primorsky region of Russia (2023) is a new challenge in control against ASF. The potential recombinant virus circulation may negate efforts to develop vaccines against ASF, vaccines that are based on genotype II strains) do not provide protection against recombinant virus.
The aim of the study was to develop qPCR for differentiation of genotype I and new recombinant ASFV variant in clinical samples from infected domestic pigs and wild boars.
Materials and methods. Samples of viral culture suspensions and biological material from pigs, ASF- free and infected with the recombinant ASFV strain Primorsky 2023/DP-4560 or genotype II strains were used. Positive control sample and standard plasmid were obtained using complex molecular cloning techniques to construct circular and linearized forms of plasmid pJET1.2_IREC.
Results. Primers and a TaqMan probe (modified with LNA, locked linear nucleic acid) were designed to the fragment of MGF 110-1L gene (93 bp). The specificity of RT-PCR was enhanced by increasing the annealing temperature to 65°C. Developed method had precision (repeatability (CV = 0.7–1.3%) and reproducibility (CV = 2.76–5.69%), 100% diagnostic specificity, 96% clinical sensitivity, and high linear dynamic range (R2 = 99.62) and efficiency (E = 95%). The limit of detection was 7 copies/µL (95% CI: 4–10 copies/µL) or 70 copies/per reaction.
Conclusion. The monoplex RT-PCR has been developed to study the extent of circulation in Russia of atypical variants originating from East Asia.
Введение. Выявление вируса африканской чумы свиней (АЧС) рекомбинантного варианта I/II генотипов в Китае (2021 г.) и его последующий занос на территорию Приморского края Российской Федерации (2023 г.) являются новыми вызовами в борьбе с болезнью. Потенциальная циркуляция данного варианта может свести на нет усилия по разработке средств специфической профилактики, поскольку известно отсутствие протективности вакцин на основе штаммов II генотипа при контрольном заражении свиней рекомбинантным штаммом вируса АЧС.
Цель работы – разработать метод полимеразной цепной реакции в режиме реального времени (ПЦР-РВ) для оперативной дифференциации вируса АЧС I генотипа и рекомбинантного варианта в различных образцах биологического материала.
Материалы и методы. Использовали образцы биологического материала от свиней, зараженных рекомбинантным штаммом «ASFV Primorsky 2023/DP-4560.Rec», штаммами II генотипа вируса АЧС и свободных от АЧС; вируссодержащей суспензии культуры клеток. С целью разработки положительного контрольного образца и количественных стандартов получали кольцевую и линеаризованную формы плазмиды pJET1.2_IREC с помощью комплексных методов молекулярного клонирования.
Результаты. Праймеры и TaqMan-зонд (в модификации LNA – замкнутых нуклеиновых кислот) для гибридизационно-флуоресцентной детекции подобраны к фрагменту гена MGF 110-1L (93 н.). Специфичность ПЦР-РВ увеличена за счет повышения температуры отжига праймеров до 65 °С. При валидации установлено, что метод обладает прецизионностью в условиях сходимости (CV = 0,7–1,3%) и воспроизводимости (CV = 2,76–5,69%), 100% диагностической специфичностью и 96% диагностической чувствительностью, линейностью (R2 = 99,62) и высокой эффективностью (Е = 95%). Предел детекции составил 7 копий/мкл (95% ДИ 4–10 копий/мкл), или 70 копий на реакцию.
Заключение. Разработан метод моноплексной ПЦР-РВ для изучения масштабов циркуляции на территории России вируса АЧС атипичных вариантов, происходящих из стран Восточной Азии.