Problems of VirologyProblems of VirologyВопросы вирусологии0507-40882411-2097Central Research Institute for Epidemiology1670510.36233/0507-4088-283hrnscvORIGINAL RESEARCHESОРИГИНАЛЬНЫЕ ИССЛЕДОВАНИЯResearch ArticleDetection of the Liman tick virus (unclassified Chuviridae) in tick cell line HAE/CTVM8Детекция Liman tick virus (неклассифицированный представитель Chuviridae) в культуре клеток клещей HAE/CTVM8https://orcid.org/0000-0002-6086-3655LitovAlexander G.ЛитовАлександр Геннадьевич
Russian Federation

PhD, leading researcher in Laboratory of Biology of Arboviruses

канд. биол. наук, ведущий научный сотрудник лаборатории биологии арбовирусов

novosti-wxo@yandex.ruhttps://orcid.org/0000-0003-1842-3899ShchetininAlexey M.ЩетининАлексей Михайлович
Russian Federation

researcher in Pathogenic Microorganisms Variability Laboratory

научный сотрудник лаборатории механизмов популяционной изменчивости патогенных микроорганизмов

shchetinin.alexey@yandex.ruhttps://orcid.org/0000-0002-3764-7081KholodilovIvan S.ХолодиловИван Сергеевич
Russian Federation

MD, PhD, leading researcher in Laboratory of Biology of Arboviruses

канд. мед. наук, ведущий научный сотрудник лаборатории биологии арбовирусов

ivan-kholodilov@bk.ruhttps://orcid.org/0000-0002-9040-0774BelovaOxana A.БеловаОксана Андреевна
Russian Federation

PhD, leading researcher in Laboratory of Biology of Arboviruses

канд. биол. наук, ведущий научный сотрудник лаборатории биологии арбовирусов

mikasusha@bk.ruhttps://orcid.org/0009-0003-1154-3852KalyanovaАnna S.КаляноваАнна Сергеевна
Russian Federation

junior researcher in Laboratory of Biology of Arboviruses

младший научный сотрудник лаборатории биологии арбовирусов

annakalyanova@bk.ruhttps://orcid.org/0000-0002-9397-3762GushchinVladimir A.ГущинВладимир Алексеевич
Russian Federation

Doctor of Biological Sciences, leading researcher and head of Pathogenic Microorganisms Variability Laboratory

д-р биол. наук, ведущий научный сотрудник, заведующий лабораторией механизмов популяционной изменчивости патогенных микроорганизмов

wowaniada@gmail.comhttps://orcid.org/0000-0002-8901-6206KarganovaGalina G.КаргановаГалина Григорьевна
Russian Federation

Doctor of Biological Sciences, professor, leading researcher and head of Laboratory of Biology of Arboviruses

д-р биол. наук, профессор, ведущий научный сотрудник, заведующая лабораторией биологии арбовирусов

karganova@bk.ruChumakov Federal Scientific Center for Research and Development of Immune-and-Biological Products of RAS (Institute of Poliomyelitis)ФГАНУ «Федеральный научный центр исследований и разработки иммунобиологических препаратов имени М.П. Чумакова РАН» (Институт полиомиелита)Institute for Translational Medicine and Biotechnology, Sechenov UniversityИнститут трансляционной медицины и биотехнологии ФГАОУ ВО «Первый Московский государственный медицинский университет имени И.М. Сеченова» Минздрава России (Сеченовский Университет)Gamaleya Federal Research Centre for Epidemiology and Microbiology, Ministry of Health of the Russian FederationФГБУ «Национальный исследовательский центр эпидемиологии и микробиологии имени почетного академика Н.Ф. Гамалеи» Минздрава РоссииFederal State Autonomous Educational Institution of Higher Education I.M. Sechenov First Moscow State Medical University of the Ministry of Health of the Russian Federation (Sechenov University)ФГАОУ ВО «Первый Московский государственный медицинский университет имени И.М. Сеченова» Минздрава России (Сеченовский Университет)3004202570214715310122024Copyright ©; 2025, Litov A.G., Shchetinin A.M., Kholodilov I.S., Belova O.A., Kalyanova А.S., Gushchin V.A., Karganova G.G.Copyright ©; 2025, Литов А.Г., Щетинин А.М., Холодилов И.С., Белова О.А., Калянова А.С., Гущин В.А., Карганова Г.Г.2025Litov A.G., Shchetinin A.M., Kholodilov I.S., Belova O.A., Kalyanova А.S., Gushchin V.A., Karganova G.G.Литов А.Г., Щетинин А.М., Холодилов И.С., Белова О.А., Калянова А.С., Гущин В.А., Карганова Г.Г.https://creativecommons.org/licenses/by/4.0https://virusjour.crie.ru/jour/article/view/16705

Introduction. Tick cell lines are widely used to study the biology of ticks and tick-borne pathogens, especially viruses. Most of the cell cultures currently available have been obtained from tick embryonic cells and can be infected with viruses. The HAE/CTVM8 cell line was obtained from Hyalomma anatolicum ticks and is often used for isolation of novel viruses.

The aim of the work is to study the HAE/CTVM8 cell line using high-throughput sequencing in order to search for viruses in it.

Materials and methods. The HAE/CTVM8 cell culture fluid was ultracentrifuged. The resulting pellet was used for high-throughput sequencing after RNA extraction, reverse transcription reaction, and synthesis of the second strand. The resulting reads were filtered by length and quality in the Trimmomatic program, after which the contigs were assembled using the SPAdes program and analyzed for the presence of viral sequences. The final assembly of the virus genome was carried out in the Ugene program. Sequence alignment was performed by the MAFFT program. The phylogenetic trees were constructed using the IQ-TREE program.

Results. We have identified the persistence of one virus, Liman tick virus (LMTV), in HAE/CTVM8 cell culture. Phylogenetically LMTV belongs to the Chuviridae – novel family, that consists of viruses detected by high-throughput sequencing, the virological characteristics of which are currently unknown.

Conclusion. The obtained information is of significant importance when utilizing HAE/CTVM8 cell culture in scientific research and during the process of isolating new viruses. Our study shows that this cell line with persistent LMTV is a ready-to-use system for studying Chuviridae reproduction

Введение. Культуры клеток клещей широко используются для изучения биологии этих членистоногих и переносимых ими патогенов, в особенности вирусов. Большинство имеющихся в настоящее время культур клеток были получены из эмбриональных клеток клещей и могут быть инфицированы вирусами. Клеточная линия HAE/CTVM8, полученная из клещей Hyalomma anatolicum, часто используется для выделения переносимых клещами внутриклеточных инфекционных агентов.

Цель работы – изучение клеточной линии HAE/CTVM8 с помощью высокопроизводительного секвенирования с целью поиска вирусов в ней.

Материалы и методы. Культуральную жидкость клеток HAE/CTVM8 ультрацентрифугировали. Полученный осадок использовали для высокопроизводительного секвенирования после выделения РНК, реакции обратной транскрипции и синтеза второй цепи. Полученные прочтения фильтровали по длине и качеству в программе Trimmomatic, после чего собирали контиги с помощью программы SPAdes и анализировали их на присутствие вирусных последовательностей. Финальная сборка генома вируса осуществлялась в программе Ugene. Выравнивание последовательностей производили с использованием программы MAFFT. Построение филогенетических деревьев производилось с применением программы IQ-TREE.

Результаты. Выявлена персистенция одного вируса – Liman tick virus (LMTV) – в культуре клеток HAE/CTVM8. Филогенетически LMTV принадлежит новому семейству Chuviridae, состоящему из вирусов, обнаруженных с помощью высокопроизводительного секвенирования, вирусологическая характеристика которых отсутствует.

Заключение. Полученная в настоящем исследовании информация крайне важна для использования культуры клеток HAE/CTVM8 в научных исследованиях и изоляции новых вирусов. Наше исследование показывает, что клеточная линия HAE/CTVM8 с персистирующим в ней LMTV представляет собой готовую систему для изучения репродукции представителей семейства Chuviridae.

Liman tick virustick cell lineHAE/CTVM8persistenceMivirusChuviridaeLiman tick virusкультура клеток клещейHAE/CTVM8персистенцияMivirusChuviridaeПравительство РФGovernment of the Russian FederationFNZG-2024-0008Marques A.R., Strle F., Wormser G.P. Comparison of Lyme disease in the United States and Europe. Emerg. Infect. Dis. 2021; 27(8): 2017–24. https://doi.org/10.3201/eid2708.204763Ruzek D., Avšič Županc T., Borde J., Chrdle A., Eyer L., Karganova G., et al. Tick-borne encephalitis in Europe and Russia: Review of pathogenesis, clinical features, therapy, and vaccines. Antiviral. Res. 2019; 164: 23–51. https://doi.org/10.1016/j.antiviral.2019.01.014Bell-Sakyi L., Zweygarth E., Blouin E.F., Gould E.A., Jongejan F. Tick cell lines: tools for tick and tick-borne disease research. Trends. Parasitol. 2007; 23(9): 450–7. https://doi.org/10.1016/j.pt.2007.07.009Mangia C., Vismarra A., Kramer L., Bell-Sakyi L., Porretta D., Otranto D., et al. Evaluation of the in vitro expression of ATP binding-cassette (ABC) proteins in an Ixodes ricinus cell line exposed to ivermectin. Parasit. Vectors. 2016; 9: 215. https://doi.org/10.1186/s13071-016-1497-2Kholodilov I.S., Litov A.G., Klimentov A.S., Belova O.A., Polienko A.E., Nikitin N.A., et al. Isolation and characterisation of Alongshan virus in Russia. Viruses. 2020; 12(4): 362. https://doi.org/10.3390/v12040362Palomar A.M., Premchand-Branker S., Alberdi P., Belova O.A., Moniuszko-Malinowska A., Kahl O., et al. Isolation of known and potentially pathogenic tick-borne microorganisms from European ixodid ticks using tick cell lines. Ticks Tick Borne Dis. 2019; 10(3): 628–38. https://doi.org/10.1016/j.ttbdis.2019.02.008Husin N.A., Khoo J.J., Zulkifli M.M.S., Bell-Sakyi L., AbuBakar S. Replication kinetics of Rickettsia raoultii in tick cell lines. Microorganisms. 2021; 9(7): 1370. https://doi.org/10.3390/microorganisms9071370Salata C., Moutailler S., Attoui H., Zweygarth E., Decker L., Bell-Sakyi L. How relevant are in vitro culture models for study of tick-pathogen interactions? Pathog. Glob. Health. 2021; 115(7-8): 437–55. https://doi.org/10.1080/20477724.2021.1944539Bell-Sakyi L. Continuous cell lines from the tick Hyalomma anatolicum anatolicum. J. Parasitol. 1991; 77(6): 1006–8.Alberdi M.P., Dalby M.J., Rodriguez-Andres J., Fazakerley J.K., Kohl A., Bell-Sakyi L. Detection and identification of putative bacterial endosymbionts and endogenous viruses in tick cell lines. Ticks Tick Borne. Dis. 2012; 3(3): 137–46. https://doi.org/10.1016/j.ttbdis.2012.05.002Attoui H., Stirling J.M., Munderloh U.G., Billoir F., Brookes S.M., Burroughs J.N., et al. Complete sequence characterization of the genome of the St Croix River virus, a new orbivirus isolated from cells of Ixodes scapularis. J. Gen. Virol. 2001; 82(Pt. 4): 795–804. https://doi.org/10.1099/0022-1317-82-4-795Litov A.G., Shchetinin A.M., Kholodilov I.S., Belova O.A., Gadzhikurbanov M.N., Ivannikova A.Y., et al. High-throughput sequencing reveals three rhabdoviruses persisting in the IRE/CTVM19 cell line. Viruses. 2024; 16(4): 576. https://doi.org/10.3390/v16040576Harvey E., Rose K., Eden J.S., Lo N., Abeyasuriya T., Shi M., et al. Extensive diversity of RNA viruses in Australian ticks. J. Virol. 2019; 93(3): e01358–18. https://doi.org/10.1128/JVI.01358-18Li C.X., Shi M., Tian J.H., Lin X.D., Kang Y.J., Chen L.J., et al. Unprecedented genomic diversity of RNA viruses in arthropods reveals the ancestry of negative-sense RNA viruses. Elife. 2015; 4: e05378. https://doi.org/10.7554/eLife.05378Ni X.B., Cui X.M., Liu J.Y., Ye R.Z., Wu Y.Q., Jiang J.F., et al. Metavirome of 31 tick species provides a compendium of 1,801 RNA virus genomes. Nat. Microbiol. 2023; 8(1): 162–73. https://doi.org/10.1038/s41564-022-01275-wShi M., Lin X.D., Tian J.H., Chen L.J., Chen X., Li C.X., et al. Redefining the invertebrate RNA virosphere. Nature. 2016; 540(7634): 539–43. https://doi.org/10.1038/nature20167Kuhn J.H., Dheilly N.M., Junglen S., Paraskevopoulou S., Shi M., Di Paola N. ICTV virus taxonomy profile: Jingchuvirales 2023. J. Gen. Virol. 2023; 104(12): 001924. https://doi.org/10.1099/jgv.0.001924Kholodilov I.S., Belova O.A., Ivannikova A.Y., Gadzhikurbanov M.N., Makenov M.T., Yakovlev A.S., et al. Distribution and characterisation of tick-borne flavi-, flavi-like, and phenuiviruses in the Chelyabinsk region of Russia. Viruses. 2022; 14(12): 2699. https://doi.org/10.3390/v14122699Salata C., Monteil V., Karlberg H., Celestino M., Devignot S., Leijon M., et al. The DEVD motif of Crimean-Congo hemorrhagic fever virus nucleoprotein is essential for viral replication in tick cells. Emerg. Microbes Infect. 2018; 7(1): 190. https://doi.org/10.1038/s41426-018-0192-0Salvati M.V., Salaris C., Monteil V., Del Vecchio C., Palù G., Parolin C., et al. Virus-derived DNA forms mediate the persistent infection of tick cells by Hazara virus and Crimean-Congo hemorrhagic fever virus. J. Virol. 2021; 95(24): e0163821. https://doi.org/10.1128/JVI.01638-21Kholodilov I.S., Belova O.A., Morozkin E.S., Litov A.G., Ivannikova A.Y., Makenov M.T., et al. Geographical and tick-dependent distribution of flavi-like Alongshan and Yanggou tick viruses in Russia. Viruses. 2021; 13(3): 458. https://doi.org/10.3390/v13030458Bolger A.M., Lohse M., Usadel B. Trimmomatic: a flexible trimmer for Illumina sequence data. Bioinformatics. 2014; 30(15): 2114–20. https://doi.org/10.1093/bioinformatics/btu170Lo C.C., Chain P.S. Rapid evaluation and quality control of next generation sequencing data with FaQCs. BMC Bioinformatics. 2014; 15(1): 366. https://doi.org/10.1186/s12859-014-0366-2Litov A.G., Semenyuk I.I., Belova O.A., Polienko A.E., Thinh N.V., Karganova G.G., et al. Extensive diversity of viruses in millipedes collected in the Dong Nai biosphere reserve (Vietnam). Viruses. 2024; 16(9): 1486. https://doi.org/10.3390/v16091486Okonechnikov K., Golosova O., Fursov M. Unipro UGENE: a unified bioinformatics toolkit. Bioinformatics. 2012; 28(8): 1166–7. https://doi.org/10.1093/bioinformatics/bts091Katoh K., Standley D.M. MAFFT multiple sequence alignment software version 7: improvements in performance and usability. Mol. Biol. Evol. 2013; 30(4): 772–80. https://doi.org/10.1093/molbev/mst010Capella-Gutiérrez S., Silla-Martínez J.M., Gabaldón T. trimAl: a tool for automated alignment trimming in large-scale phylogenetic analyses. Bioinformatics. 2009; 25(15): 1972–3. https://doi.org/10.1093/bioinformatics/btp348Nguyen L.T., Schmidt H.A., von Haeseler A., Minh B.Q. IQ-TREE: a fast and effective stochastic algorithm for estimating maximum-likelihood phylogenies. Mol. Biol. Evol. 2015; 32(1): 268–74. https://doi.org/10.1093/molbev/msu300Kalyaanamoorthy S., Minh B.Q., Wong T.K.F., von Haeseler A., Jermiin L.S. ModelFinder: fast model selection for accurate phylogenetic estimates. Nat. Methods. 2017; 14(6): 587–9. https://doi.org/10.1038/nmeth.4285Zhang Y., Hu B., Agwanda B., Fang Y., Wang J., Kuria S., et al. Viromes and surveys of RNA viruses in camel-derived ticks revealing transmission patterns of novel tick-borne viral pathogens in Kenya. Emerg. Microbes Infect. 2021; 10(1): 1975–87. https://doi.org/10.1080/22221751.2021.1986428Abrao E.P., da Fonseca B.A. Infection of mosquito cells (C6/36) by Dengue-2 virus interferes with subsequent infection by yellow fever virus. Vector. Borne Zoonotic Dis. 2016; 16(2): 124–30. https://doi.org/10.1089/vbz.2015.1804Kuwata R., Isawa H., Hoshino K., Sasaki T., Kobayashi M., Maeda K., et al. Analysis of mosquito-borne flavivirus superinfection in Culex tritaeniorhynchus (Diptera: Culicidae) cells persistently infected with Culex flavivirus (Flaviviridae). J. Med. Entomol. 2015; 52(2): 222–9. https://doi.org/10.1093/jme/tju059Patterson E.I., Kautz T.F., Contreras-Gutierrez M.A., Guzman H., Tesh R.B., Hughes G.L., et al. Negeviruses reduce replication of alphaviruses during coinfection. J. Virol. 2021; 95(14): e0043321. https://doi.org/10.1128/JVI.00433-21