Problems of VirologyProblems of VirologyВопросы вирусологии0507-40882411-2097Central Research Institute for Epidemiology1457210.36233/0507-4088-186mvcgomORIGINAL RESEARCHESОРИГИНАЛЬНЫЕ ИССЛЕДОВАНИЯResearch ArticleAdaptation of african swine fever virus (Asfarviridae: Asfivirus)to growth in the continuous culture PPK-66b cells by the method of accelerated passagingАдаптация вируса африканской чумы свиней (Asfarviridae: Asfivirus) к росту в перевиваемой культуре клеток ППК-66б методом ускоренного пассированияhttps://orcid.org/0000-0001-8707-7710VlasovaNatalia N.ВласоваНаталья Никифоровна
Russian Federation

Dr of Biol. Sci., Principal Researcher of the Laboratory of Biochemistry and Molecular Biology

д.б.н., старший научный сотрудник, главный научный сотрудник лаборатории биохимии и молекулярной биологии

vlanany@yandex.ruhttps://orcid.org/0000-0001-8584-8251ChernykhOleg Yu.ЧерныхОлег Юрьевич
Russian Federation

Dr of Vet. Sci., Professor, Director

д.в.н., профессор, директор

gukkvl50@kubanvet.ruhttps://orcid.org/0009-0008-4580-6776KrivonosRoman A.КривоносРоман Анатольевич
Russian Federation

Ph.D. of Vet. Sci., Head

к.в.н., руководитель

uv@krasnodar.ruhttps://orcid.org/0000-0003-0784-9341VerkhovskyOleg A.ВерховскийОлег Анатольевич
Russian Federation

Dr of Biol. Sci., Professor, President

д.б.н., профессор, президент

info@dpri.ruhttps://orcid.org/0000-0003-2696-1363AliperTaras I.АлиперТарас Иванович
Russian Federation

Dr. of Biol. Sci., Professor, Head of the Laboratory of Epizootology, diagnostics and prevention of viral diseases of pigs

д.б.н., профессор, заведующий лабораторией эпизоотологии, диагностики и профилактики вирусных болезней свиней

aliper@vetbio.ruhttps://orcid.org/0000-0002-6579-779XAnoyatbekovaAfshona M.АноятбековаАфшона Музафарбековна
Russian Federation

Ph.D.of Vet. Sci., Senior Researcher, Laboratory of Biochemistry and Molecular Biology

к. в. н., старший научный сотрудник лаборатории биохимии и молекулярной биологии

aafshona@mail.ruhttps://orcid.org/0000-0001-7423-6102ZhukovaElena V.ЖуковаЕлена Вячеславовна
Russian Federation

Ph.D. Sc., Leading Researcher, Laboratory of Biochemistry and of Molecular Biology

к. б. н., ведущий научный сотрудник лаборатории биохимии и молекулярной биологии

evz-sk@mail.ruhttps://orcid.org/0000-0002-2161-9406KucherukOksana D.КучерукОксана Дмитриевна
Russian Federation

Ph.D. of Vet. Sci., Leading Researcher, Laboratory of Biochemistry and Molecular Biology

к. в. н., ведущий научный сотрудник лаборатории биохимии и молекулярной биологии

kussike17@yandex.ruhttps://orcid.org/0000-0002-9354-6824YuzhakovAnton G.ЮжаковАнтон Геннадиевич
Russian Federation

Ph.D. of Biol. Sci., Head of the Laboratory of Biochemistry and Molecular Biology

к. б. н., заведующий лабораторией биохимии и молекулярной биологии

anton_oskol@mail.ruhttps://orcid.org/0000-0002-7489-6175GulyukinMikhail I.ГулюкинМихаил Иванович
Russian Federation

Dr. of Vet.Sci., Academician of RAS, Head of Scientific Areas Center in the administration

д.в.н., академик РАН, руководитель научных направлений центра в администрации

admin@viev.ruhttps://orcid.org/0000-0003-2160-4770GulyukinAleksey M.ГулюкинАлексей Михайлович
Russian Federation

Dr. of Vet. Sci., Corresponding Member RAS, Director

д.в.н., член-кор. РАН, директор

admin@viev.ruFederal Scientific Center – All-Russian Research Institute of Experimental Veterinary Medicine named after V.I. K.I. Scriabin and Ya.R. Kovalenko of the Russian Academy of SciencesФГБНУ «Федеральный научный центр – Всероссийский научно-исследовательский институт экспериментальной ветеринарии им. К.И. Скрябина и Я.Р. Коваленко Российской академии наук»Department of Veterinary Medicine of the Krasnodar TerritoryДепартамент ветеринарии Краснодарского краяResearch Institute for Diagnosis and Prevention of Human and Animal DiseasesАНО «Научно-исследовательский институт диагностики и профилактики болезней человека и животных»2109202368433434225072023Copyright ©; 2023, Vlasova N.N., Chernykh O.Y., Krivonos R.A., Verkhovsky O.A., Aliper T.I., Anoyatbekova A.M., Zhukova E.V., Kucheruk O.D., Yuzhakov A.G., Gulyukin M.I., Gulyukin A.M.Copyright ©; 2023, Власова Н.Н., Черных О.Ю., Кривонос Р.А., Верховский О.А., Алипер Т.И., Аноятбекова А.М., Жукова Е.В., Кучерук О.Д., Южаков А.Г., Гулюкин М.И., Гулюкин А.М.2023Vlasova N.N., Chernykh O.Y., Krivonos R.A., Verkhovsky O.A., Aliper T.I., Anoyatbekova A.M., Zhukova E.V., Kucheruk O.D., Yuzhakov A.G., Gulyukin M.I., Gulyukin A.M.Власова Н.Н., Черных О.Ю., Кривонос Р.А., Верховский О.А., Алипер Т.И., Аноятбекова А.М., Жукова Е.В., Кучерук О.Д., Южаков А.Г., Гулюкин М.И., Гулюкин А.М.https://creativecommons.org/licenses/by/4.0https://virusjour.crie.ru/jour/article/view/14572

Introduction. African swine fever virus (ASF) is a large, enveloped virus with an icosahedral capsid morphology and a double-stranded DNA genome ranging in size from 170 to 190 kb. The replication cycle proceeds in two phases, the early phase lasting 4–6 hours and the late 8–20 hours after infection. The adaptation of the ASF virus to growth in continuous cell lines makes efficient and reliable genetic analysis and more accurate interpretation of its results.

Objective. Adaptation of a new isolate of the ASF virus to growth in a continuous cell line by the method of accelerated passages and preliminary genetic analysis of the resulting strain.

Materials and methods. For virus isolation and passaging of the ASF virus, a porcine leukocyte cell culture (PL) and continuous cell cultures of porcine origin (ST, PK, PPK-66b) were used with Eagle MEM and HLA essential media with 10% porcine or fetal serum.

Results. The article presents data on the isolation and analysis of the changes in the reproductive properties of a new African swine fever (ASF) virus isolate in the process of adaptation to growth in a continuous piglet kidney cell culture clone b (PPK-66b). The current state of the problem of cultivation of the ASF virus, the features of its reproduction, and the basis of the genetic differentiation of its isolates are described in detail. Understanding the uniqueness of the nature of the ASF virus determined the approaches to the processes of its cultivation and adaptation. In this regard, the results of studies of cultural properties, and analysis of the nucleotide sequence of 6 genes of the new isolate, as well as phylogenetic analysis of these genes with already known strains and isolates of the ASF virus are presented.

Conclusion. A new strain obtained in the process of cell adaptation of ASVF/Znaury/PPK-23 ASF virus by the accelerated passaging method reaches a high level of reproduction in 72 hours with an accumulation titer of 7.07 lg HAdE50/cm3. Primary genetic analysis allowed to establish the main phylogenetic relationships of the newly isolated strain with previously known variants of the current ASF panzootic.

Введение. Вирус африканской чумы свиней (АЧС) представляет собой крупный оболочечный вирус с икосаэдрической морфологией капсида и двухцепочечным ДНК-геномом, размеры которого варьируют от 170 до 190 т.п.о. Цикл репликации протекает в две фазы, причем длительность ранней фазы составляет 4–6 ч, а поздней – 8–20 ч после заражения. Адаптация вируса АЧС к росту в определенных клеточных линиях позволяет провести эффективный и достоверный генетический анализ и более четко интерпретировать его результаты.

Цель. Адаптация нового изолята вируса АЧС к росту в перевиваемой линии клеток методом коротких пассажей и предварительный генетический анализ полученного штамма.

Материалы и методы. Для вирусовыделения, пассирования вируса АЧС использовали первичную культуру клеток лейкоцитов свиньи (ЛС) и перевиваемые культуры клеток свиного происхождения (ПТП, ПС, ППК-66б) с использованием питательных сред Игла МЭМ и ГЛА с 10% свиной или фетальной сыворотки.

Результаты. В статье представлены данные по выделению и анализу изменений репродуктивных свойств нового изолята вируса АЧС в процессе адаптации к росту в перевиваемой культуре клеток почки поросенка (ППК-66б). Подробно описаны современное состояние проблемы культивирования вируса АЧС, особенности его репродукции и основы генетической дифференциации его изолятов. Понимание уникальности природы вируса АЧС определило подходы к процессам его культивирования и адаптации. В связи с этим приводятся результаты исследований культуральных свойств и анализа нуклеотидной последовательности 6 генов нового изолята, а также филогенетического анализа этих генов с уже известными штаммами и изолятами вируса АЧС.

Заключение. Полученный в процессе адаптации методом коротких пассажей новый штамм ASVF/Znaury/PPK-23 вируса АЧС за 72 ч достигает высокого уровня накопления с титром 7,07 lgГАдЕ50/см3. Первичный генетический анализ позволил установить основные филогенетические связи вновь выделенного изолята с ранее известными вариантами текущей панзоотии АЧС.

African swine fever virus (ASFV)genome structurefeatures of replication, continuous cell linesvirus-mediated hemadsorption (HAd), phylogenetic analysisвирус африканской чумы свинейструктура геномаособенности репликации, перевиваемые линии клетоквирус-опосредованная гемадсорбция, филогенетический анализФГБНУ ФНЦ ВИЭВ РАНVIEV RASFGUG-2022-18Salas M.L., Andrés G. African swine fever virus morphogenesis. Virus Res. 2013; 173(1): 29–41. https://doi.org/10.1016/j.virusres.2012.09.016Rojo G., García-Beato R., Viñuela E., Salas M.L., Salas J. Replication of African swine fever virus DNA in infected cells. Virology. 1999; 257(2): 524–36. https://doi.org/10.1006/viro.1999.9704García-Beato R., Salas M.L., Viñuela E., Salas J. Role of the host cell nucleus in the replication of African swine fever virus DNA. Virology. 1992; 188(2): 637–49. https://doi.org/10.1016/0042-6822(92)90518-tBreese S.S. Jr., DeBoer C.J. Electron microscope observations of African swine fever virus in tissue culture cells. Virology. 1966; 28(3): 420–8. https://doi.org/10.1016/0042-6822(66)90054-7Casal I., Enjuanes L., Viñuela E. Porcine leukocyte cellular subsets sensitive to African swine fever virus in vitro. J. Virol. 1984; 52(1): 37–46. https://doi.org/10.1128/JVI.52.1.37-46.1984Wardley R.C., Wilkinson P.J. The growth of virulent African swine fever virus in pig monocytes and macrophages. J. Gen. Virol. 1978; 38(1): 183–6. https://doi.org/10.1099/0022-1317-38-1-183Gómez-Villamandos J.C., Hervás J., Méndez A., Carrasco L., Martín de las Mulas J., Villeda C.J., et al. Experimental African swine fever: apoptosis of lymphocytes and virus replication in other cells. J. Gen. Virol. 1995; 76 ( Pt 9): 2399–405. https://doi.org/10.1099/0022-1317-76-9-2399Gómez-Villamandos J.C., Hervás J., Méndez A., Carrasco L., Martín de las Mulas J., Villeda C.J., et al. Experimental African swine fever: apoptosis of lymphocytes and virus replication in other cells. J. Gen. Virol. 1995; 76 (Pt. 9): 2399–405. https://doi.org/10.1099/0022-1317-76-9-2399Sierra M.A., Bernabe A., Mozos E., Mendez A., Jover A. Ultrastructure of the liver in pigs with experimental African swine fever. Vet. Pathol. 1987; 24(5): 460–2. https://doi.org/10.1177/030098588702400516Carrasco L., de Lara F.C., Martín de las Mulas J., Gómez-Villamandos J.C., Pérez J., Wilkinson P.J., et al. Apoptosis in lymph nodes in acute African swine fever. J. Comp. Pathol. 1996; 115(4): 415–28. https://doi.org/10.1016/s0021-9975(96)80075-2Esteves A., Marques M.I., Costa J.V. Two-dimensional analysis of African swine fever virus proteins and proteins induced in infected cells. Virology. 1986; 152(1): 192–206. https://doi.org/10.1016/0042-6822(86)90384-3Baylis S.A., Banham A.H., Vydelingum S., Dixon L.K., Smith G.L. African swine fever virus encodes a serine protein kinase which is packaged into virions. J. Virol. 1993; 67(8): 4549–56. https://doi.org/10.1128/JVI.67.8.4549-4556.1993Krug P.W., Holinka L.G., O’Donnell V., Reese B., Sanford B., Fernandez-Sainz I., et al. The progressive adaptation of a georgian isolate of African swine fever virus to vero cells leads to a gradual attenuation of virulence in swine corresponding to major modifications of the viral genome. J. Virol. 2015; 89(4): 2324–32. https://doi.org/10.1128/JVI.03250-14Krug P.W., Holinka L.G., O’Donnell V., Reese B., Sanford B., Fernandez-Sainz I., et al. The progressive adaptation of a Georgian isolate of African swine fever virus to vero cells leads to a gradual attenuation of virulence in swine corresponding to major modifications of the viral genome. J. Virol. 2015; 89(4): 2324–32. https://doi.org/10.1128/JVI.03250-14Mazloum A., Igolkin A.S., Zinyakov N.G., Van Schalkwyk A., Vlasova N.N. Changes in the genome of African swine fever virus (Asfarviridae: Asfivirus: African swine fever virus) associated with adaptation to reproduction in continuous cell culture. Voprosy virusologii. 2021; 66(3): 211–6. https://doi.org/10.36233/0507-4088-50 (in Russian)Мазлум А.А., Иголкин А.С., Зиняков Н.Г., ван Шалквик А., Власова Н.Н. Геномные изменения вируса африканской чумы свиней (Asfarviridae: Asfivirus: African swine fever virus), связанные с адаптацией к размножению в перевиваемой культуре клеток. Вопросы вирусологии. 2021; 66(3): 211–6. https://doi.org/10.36233/0507-4088-50 https://elibrary.ru/eqrwmoPrudnikova E.Yu., Balyshev V.M., Yurkov S.G., Gal’nbek T.V., Blysheva V.I. Adaptation of African swine fever virus to continuous cell cultures. Nauchnyy zhurnal KubGAU. 2012; (80): 70–9. https://elibrary.ru/pbuuyj (in Russian)Прудникова Е.Ю., Балышев В.М., Юрков С.Г., Гальнбек Т.В., Блышева В.И. Адаптация вируса африканской чумы свиней к перевиваемым культурам клеток. Научный журнал КубГАУ. 2012; (80): 70–9. https://elibrary.ru/pbuuyjBoinas F.S., Hutchings G.H., Dixon L.K., Wilkinson P.J. Characterization of pathogenic and non-pathogenic African swine fever virus isolates from Ornithodoros erraticus inhabiting pig premises in Portugal. J. Gen. Virol. 2004; 85(Pt. 8): 2177–87. https://doi.org/10.1099/vir.0.80058-0Boinas F.S., Hutchings G.H., Dixon L.K., Wilkinson P.J. Characterization of pathogenic and non-pathogenic African swine fever virus isolates from Ornithodoros erraticus inhabiting pig premises in Portugal. J. Gen. Virol. 2004; 85(Pt 8): 2177–87. https://doi.org/10.1099/vir.0.80058-0Borca M.V., Rai A., Ramirez-Medina E., Silva E., Velazquez-Salinas L., Vuono E., et al. A Cell culture-adapted vaccine virus against the current African swine fever virus pandemic strain. J. Virol. 2021; 95(14): e0012321. https://doi.org/10.1128/JVI.00123-21Borca M.V., Rai A., Ramirez-Medina E., Silva E., Velazquez-Salinas L., Vuono E., et al. A Cell Culture-Adapted Vaccine Virus against the Current African Swine Fever Virus Pandemic Strain. J. Virol. 2021; 95(14): e0012321. https://doi.org/10.1128/JVI.00123-21Monteagudo P.L., Lacasta A., López E., Bosch L., Collado J., Pina-Pedrero S., et al. BA71ΔCD2: a new recombinant live attenuated African swine fever virus with cross-protective capabilities. J. Virol. 2017; 91(21): e01058–17. https://doi.org/10.1128/JVI.01058-17Monteagudo P.L., Lacasta A., López E., Bosch L., Collado J., Pina-Pedrero S., et al. BA71ΔCD2: a New Recombinant Live Attenuated African Swine Fever Virus with Cross-Protective Capabilities. J. Virol. 2017; 91(21): e01058–17. https://doi.org/10.1128/JVI.01058-17Reis A.L., Goatley L.C., Jabbar T., Sanchez-Cordon P.J., Netherton C.L., Chapman D.A.G., et al. Deletion of the African swine fever virus gene DP148R does not reduce virus replication in culture but reduces virus virulence in pigs and induces high levels of protection against challenge. J. Virol. 2017; 91(24): e01428–17. https://doi.org/10.1128/JVI.01428-17Reis A.L., Goatley L.C., Jabbar T., Sanchez-Cordon P.J., Netherton C.L., Chapman D.A.G., et al. Deletion of the African Swine Fever Virus Gene DP148R Does Not Reduce Virus Replication in Culture but Reduces Virus Virulence in Pigs and Induces High Levels of Protection against Challenge. J. Virol. 2017; 91(24): e01428–17. https://doi.org/10.1128/JVI.01428-17Neilan J.G., Zsak L., Lu Z., Kutish G.F., Afonso C.L., Rock D.L. Novel swine virulence determinant in the left variable region of the African swine fever virus genome. J. Virol. 2002; 76(7): 3095–104. https://doi.org/10.1128/jvi.76.7.3095-3104.2002Gallardo C., Mwaengo D.M., Macharia J.M., Arias M., Taracha E.A., Soler A., et al. Enhanced discrimination of African swine fever virus isolates through nucleotide sequencing of the p54, p72, and pB602L (CVR) genes. Virus Genes. 2009; 38(1): 85–95. https://doi.org/10.1007/s11262-008-0293-2Elsukova A.A., Shevchenko I.V., Varentsova A.A., Zinyakov N.G., Igolkin A.S., Vlasova N.N. Comparative analysis of molecular and biological properties of African swine fever virus isolates collected in 2013 from Russian Federation. In: Abstracts 8th Annual EPIZONE Meeting «Primed for Tomorrow». Frideriksberg; 2014.Elsukova A.A., Shevchenko I.V., Varentsova A.A., Zinyakov N.G., Igolkin A.S., Vlasova N.N. Comparative analysis of molecular and biological properties of African swine fever virus isolates collected in 2013 from Russian Federation. Abstracts 8th Annual EPIZONE Meeting “Primed for tomorrow”. Frideriksberg, 2014.Dixon L.K., Chapman D.A., Netherton C.L., Upton C. African swine fever virus replication and genomics. Virus Res. 2013; 173(1): 3–14. https://doi.org/10.1016/j.virusres.2012.10.020Bastos A.D., Penrith M.L., Crucière C., Edrich J.L., Hutchings G., Roger F., et al. Genotyping field strains of African swine fever virus by partial p72 gene characterisation. Arch. Virol. 2003; 148(4): 693–706. https://doi.org/10.1007/s00705-002-0946-8Gallardo C., Mwaengo D.M., Macharia J.M., Arias M., Taracha E.A., Soler A., et al. Enhanced discrimination of African swine fever virus isolates through nucleotide sequencing of the p54, p72, and pB602L (CVR) genes. Virus Genes. 2009; 38(1): 85–95. https://doi.org/10.1007/s11262-008-0293-2Borca M.V., Kutish G.F., Afonso C.L., Irusta P., Carrillo C., Brun A., et al. An African swine fever virus gene with similarity to the T-lymphocyte surface antigen CD2 mediates hemadsorption. Virology. 1994; 199(2): 463–8. https://doi.org/10.1006/viro.1994.1146