In vitro and in vivo laboratory models for Orthopoxviruses (Poxviridae: Orthopoxvirus): current approaches, limitations, and future perspectives

Full Text

Введение

Биология и патогенез

Ортопоксвирусы представляют собой крупные ДНК-содержащие вирусы с двухцепочечным геномом размером 140–350 тыс. пар нуклеотидов, репликация которых полностью осуществляется в цитоплазме инфицированных клеток [1–3]. Семейство Poxviridae делится на два подсемейства: Entomopoxvirinae (вирусы насекомых) и Chordopoxvirinae (вирусы позвоночных). Род Orthopoxvirus относится к подсемейству Chordopoxvirinae и включает вирусы натуральной оспы, оспы обезьян, коровьей оспы, осповакцины и др.¹

Согласно данным Международного комитета по таксономии вирусов, род Orthopoxvirus насчитывает около 18 видов¹. Характерной особенностью данных вирусов является широкий круг хозяев, что обусловливает их зоонозный потенциал.

В отличие от большинства ДНК-вирусов, ортопоксвирусы обладают высокой степенью автономности, поскольку кодируют собственные ферменты, включая ДНК-зависимую РНК-полимеразу и факторы транскрипции. Это обеспечивает независимость их репликации от ядерного аппарата клетки.

Репликация ортопоксвирусов представляет собой многоэтапный процесс, начинающийся с прикрепления вируса к клетке и проникновения посредством эндоцитоза или слияния мембран. После разупаковки в цитоплазме происходит ранняя транскрипция с участием вирусных ферментов, в ходе которой синтезируются белки, необходимые для репликации ДНК и подавления клеточных защитных механизмов [3, 4].

Репликация генома и последующая сборка вирионов происходят в специализированных цитоплазматических структурах – «вирусных фабриках». Поздняя транскрипция обеспечивает синтез структурных белков, после чего формируются зрелые вирусные частицы. Выход вируса осуществляется либо путем лизиса клетки, либо посредством экзоцитоза [3–5].

Передача ортопоксвирусов осуществляется несколькими путями. Наиболее значимым является аэрозольный (капельный) путь, реализующийся при вдыхании инфицированных частиц. Контактный путь передачи возможен при непосредственном соприкосновении с пораженной кожей или биологическими жидкостями инфицированного. Кроме того, для ряда ортопоксвирусов характерен зоонозный механизм передачи, при котором источником инфекции выступают инфицированные животные [6, 7].

Патогенез ортопоксвирусных инфекций включает последовательные этапы: первичную репликацию в эпителии дыхательных путей или кожи, распространение в регионарные лимфатические узлы, развитие виремии и вторичную репликацию в коже, слизистых оболочках и внутренних органах. Клинические проявления характеризуются лихорадкой, интоксикацией и типичной стадийной сыпью (макула, папула, везикула, пустула, корка) [2, 6, 7].

Важную роль играет иммунопатогенез. Ортопоксвирусы способны эффективно подавлять иммунный ответ за счет ингибирования интерфероновой системы, блокады комплемента, подавления апоптоза и синтеза вирусных аналогов цитокинов [6].

Вирулентность ортопоксвирусов определяется их способностью к иммунному уклонению, широким спектром хозяев и генетической пластичностью. Геном вирусов подвержен изменениям, включая приобретение и утрату генов, что способствует адаптации к новым хозяевам и условиям существования [8].

Ортопоксвирусы имеют древнее происхождение и длительную историю коэволюции с хозяевами. После ликвидации натуральной оспы снижение коллективного иммунитета привело к увеличению значимости зоонозных ортопоксвирусов, особенно вируса оспы обезьян (MPXV) [9].

Таким образом, ортопоксвирусы представляют собой важную модель взаимодействия вируса и хозяина, обладающую высокой адаптивностью, сложными механизмами иммунного уклонения и значительным эпидемиологическим потенциалом, что определяет актуальность их дальнейшего изучения.

Актуальность, роль экспериментальных моделей

Изучение ортопоксвирусов активно проводилось до ликвидации натуральной оспы в 1980-х гг., после чего интерес к ним снизился. Однако в последние годы он вновь возрос из-за вспышек оспы обезьян, коровьей, верблюжьей и других зоонозных ортопоксвирусных инфекций, что подчеркнуло необходимость изучения их передачи, профилактики и лечения [10].

Вспышки ортопоксвирусов неоднократно регистрировали по всему миру: оспа обезьян – в Африке и США [11, 12], коровья оспа – в Европе [13], оспа верблюдов – в Юго-Западной и Центральной Азии [14, 15], оспа буйволов – в Юго-Восточной Азии [16–18], вирус осповакцины – в Южной Америке [19]. Ослабление иммунитета к натуральной оспе способствует передаче вирусов от животных к человеку и их дальнейшему распространению. Это подтверждается, например, вспышкой оспы обезьян в ДР Конго в 2017 г. (88 случаев, 6 летальных исходов) [20], где наибольшая заболеваемость отмечалась среди невакцинированных молодых лиц [21].

Отмечены случаи межвидовой передачи: в 2011 г. в Индии и в 2014 г. в Судане вирус оспы верблюдов (ВОВ) вызвал заболевания у человека [22–25]. Высокая гомология генома (до 99%) с вирусом натуральной оспы (VARV) и выявленные мутации повышают риск появления эпидемически значимых вариантов [26–32]. Также выявляются новые ортопоксвирусы, такие как вирус Ахмета (Грузия) [33, 34] и вирус оспы кошек (2017 г.) [35], что указывает на возрастающую роль этой группы в патологии человека.

Разработка средств профилактики и лечения требует использования адекватных животных моделей [36]. Исторически вакцины получали с использованием животных, однако этот метод связан с риском контаминации. Вакцины 2-го поколения, выращенные на клеточных культурах, безопаснее, но могут вызывать побочные реакции [10, 27, 37, 38]. Вакцины 3-го поколения представляют собой аттенуированные штаммы, полученные при пассажах в культурах клеток [28], а 4-го – ДНК- и рекомбинантные субъединичные вакцины. Все типы вакцин разрабатываются с использованием моделей in vitro и in vivo.

Целью настоящей обзорной статьи является анализ современных экспериментальных моделей ортопоксвирусных инфекций, используемых для изучения биологических свойств вирусов рода Orthopoxvirus, механизмов патогенеза, особенностей взаимодействия с организмом хозяина, а также оценки эффективности противовирусных препаратов и вакцин. Особое внимание уделено сравнению возможностей и ограничений моделей in vitro и in vivo, их роли в исследовании зоонозных ортопоксвирусов и перспективам совершенствования экспериментальных подходов для решения актуальных задач вирусологии, медицины и ветеринарии.

Материалы и методы

Настоящее исследование выполнено в формате обзорной работы с использованием систематизированного анализа научной литературы, посвященной экспериментальным моделям ортопоксвирусных инфекций.

Этап 1. Поиск литературных источников. Был проведен поиск научных публикаций в международных базах данных PubMed, Scopus, Web of Science, а также в открытых научных ресурсах. Дополнительно использовали данные специализированных вирусологических обзоров и отчетов международных организаций.

Этап 2. Анализ in vitro моделей. Выполняли сравнительный анализ клеточных систем, включая линии Vero, RK-13, CV-1, HeLa, BSC-40, HaCaT, MA-104, а также первичные культуры клеток и 3D-органоиды. Оценивали чувствительность к различным ортопоксвирусам, характер репродукции вируса, выраженность цитопатического действия, применимость для скрининга противовирусных препаратов.

Этап 3. Анализ in vivo моделей. Систематизировали данные по животным моделям: нечеловекообразные приматы, мыши (Mus musculus), кролики (Oryctolagus cuniculus), луговые собачки (Cynomys ludovicianus), а также обобщение по альтернативным грызунам. Оценивали клиническое течение инфекции, иммунный ответ, летальность, а также пригодность моделей для изучения патогенеза и оценки вакцин.

Этап 4. Сравнительный анализ моделей. Проводили сопоставление in vitro и in vivo систем по нескольким критериям.

Этап 5. Обобщение и структурирование результатов. На заключительном этапе данные были систематизированы и представлены в виде аналитических таблиц и текстового обобщения, отражающих современные подходы к моделированию ортопоксвирусных инфекций и перспективы их развития.

Результаты

Модели in vitro

Модели in vitro являются фундаментальным инструментом для изучения молекулярных и клеточных механизмов репликации ортопоксвирусов, а также для первичного скрининга противовирусных препаратов. Эти системы, основанные на использовании клеточных культур, позволяют детально анализировать такие процессы, как проникновение вируса в клетку, транскрипция и трансляция вирусных генов, сборка и выход новых вирусных частиц. Благодаря возможности строго контролировать условия эксперимента, модели in vitro обеспечивают высокую воспроизводимость результатов и минимизируют влияние внешних факторов, что критически важно для понимания сложных вирус-клеточных взаимодействий.

Культуральные свойства вируса оспы верблюдов (ВОВ)

ВОВ может размножаться в большом числе культур клеток, включая следующие клеточные линии: Vero, MA-104, клетки почки макаки-резус, клетки почки детеныша хомяка, клетки кожи дубайского верблюда (Dubca), а также следующие первичные культуры клеток: клетки тестикул ягненка, клетки почки ягненка (ПЯ), клетки эмбриона верблюда, клетки почки теленка и фибробласт эмбриона цыпленка [39, 40].

Сотрудниками научно-исследовательского института проблем биологической безопасности (НИИПББ) в рамках грантовых проектов были выделены эпизоотические штаммы М-96 и М-2020 ВОВ [41, 42], изучены их репродуктивные свойства на чувствительных биологических системах с использованием первично-трипсинизированных и перевиваемых линий клеточных культур [42, 43]. Кроме того, получен аттенуированный штамм ВОВ методом последовательных пассажей на первично-трипсинизированной культуре клеток ПЯ [42], который характеризуется высокой биологической активностью и высоким репродуктивным свойством. Культивирование вируса осуществляли стационарным способом при температуре 37 ± 0,5 °С в течение 2–5 сут, накопление вируса происходило до 7,62 lg ТЦД₅₀ (50% инфекционной дозы для культуры ткани)/мл при заражающей дозе 0,01 ТЦД₅₀/мл. При этом репродукция вируса выражалась в деструктивном изменении монослоя в виде блестящих светопреломляющих клеток разной формы (круглые, веретенообразные, овальные) с четкими очертаниями оболочек ядра и цитоплазмы.

При выделении штамма М-2020 ВОВ из суспензии биопсийных образцов (корочки и соскобы с оспенных папул кожи), отобранных от больных животных во время вспышки оспы верблюдов из разных районов Мангистауской области в конце 2019 г., также использовали первичную культуру клеток ПЯ [42].

Суданскими учеными на основе эпизоотического штамма ВОВ, выделенного от больных верблюдов во время вспышки оспы верблюдов в районе Butana на востоке Судана, была разработана вакцина против оспы верблюдов. Авторы провели 115 пассажей в культуре клеток Vero и получили безопасный и эффективный аттенуированный штамм ВОВ [44].

Культуральные свойства вируса оспы коров (ВОК) и осповакцины (VACV)

Для культивирования вирусов на клеточных культурах используют клетки из различных биологических объектов, размножаемые на искусственных питательных средах в лабораторной посуде, а в качестве подтверждения репродукции применяют методы индикации и идентификации.

В рамках научно-технической программы сотрудниками НИИПББ были изучены культуральные свойства ВОК и VACV. При этом определены чувствительные клеточные линии, оптимальные условия культивирования в зависимости от множественности инфицирующей дозы, сроков и температуры культивирования [39]. Среди протестированных клеточных культур наиболее продуктивными для накопления вируса оказались линии ПЯ и почки африканской зеленой мартышки (Vero). Во всех случаях отмечалось выраженное цитопатическое действие. Вирусы накапливались с биологической активностью 5,10–5,15 и 5,07–5,10 lg ТЦД₅₀/мл соответственно при заражающей дозе 0,01 ТЦД₅₀/клетку. При этом оптимальным условием культивирования являлась температура 37,0 ± 0,5 °С. Также в рамках научно-технической программы был получен аттенуированный штамм ВОК из вирулентного штамма Cowpox CAM путем длительного пассирования исходного вируса в культуре клеток ПЯ [45].

Российскими учеными на основе штамма LIVP вируса VACV, используемого для вакцинации, был создан рекомбинантный вариант 1421ABJCN с нарушением 5 генов вирулентности, кодирующих гемагглютинин (A56R), γ-интерферон-связывающий белок (B8R), тимидинкиназу (J2R), комплемент-связывающий белок (C3L) и Bcl-2-подобный ингибитор апоптоза (N1L) [46]. Показано, что инактивация выбранных генов вирулентности не влияла на репродуктивные свойства VACV на культурах клеток Vero и CV-1, Vero и 4647. Также при разработке чувствительного и быстрого иммунохимического теста для выявления ортопоксвирусов во внелабораторных условиях при культивировании и выделении вирусов VACV, эктромелии, оспы коров и оспы кроликов использовали монослой клеточной культуры линии CV-1 [47], где вирусы инкубировали в течение 72 ч при температуре 37 °С до полного цитопатического действия.

Установлено, что клетки линий HeLa, BSC-40, RK-13 и HaCaT также обладают чувствительностью к разным ортопоксвирусам и могут использоваться для изучения цитопатического действия, репликации вируса и тестирования противовирусных соединений [48]. Одним из перспективных направлений является использование моделей совместного культивирования клеток иммунной системы и эпителиальных клеток, позволяющих исследовать механизмы врожденного иммунного ответа, продукцию цитокинов и влияние вируса на межклеточные взаимодействия [49]. Показано, что ортопоксвирусы способны ингибировать сигнальные пути интерферонового ответа и модулировать апоптоз инфицированных клеток, обеспечивая эффективную репликацию вируса [50].

Культуральные свойства вируса оспы обезьян (MPXV)

MPXV характеризуется широким спектром чувствительных клеточных культур и способен эффективно реплицироваться как в первичных, так и в перевиваемых линиях клеток млекопитающих [51]. Для выделения, накопления и изучения биологических свойств MPXV наиболее широко применяют клеточные линии Vero, Vero E6, Vero 76, LLC-MK2, MA-104, BSC-40, RK-13, CV-1, HeLa и HaCaT [51–53]. Высокая чувствительность данных культур к вирусу позволяет использовать их для исследования цитопатического действия, оценки вирулентности штаммов, изучения механизмов вирусной репликации и скрининга противовирусных препаратов.

Наиболее часто для культивирования MPXV используют клетки Vero и Vero E6, выращиваемые в средах RPMI-1640, DMEM, EMEM или MEM с добавлением 2–10% фетальной бычьей сыворотки, антибиотиков и антимикотиков при температуре 37 °С в атмосфере с содержанием 5% CO₂ [51]. Инфицирование клеток обычно проводят при множественности заражения (MOI) от 0,001 до 5,0 с последующей инкубацией в течение 1–8 сут в зависимости от целей исследования. Репродукция вируса сопровождается выраженным цитопатическим действием, характеризующимся округлением клеток, образованием синцитиев, вакуолизацией цитоплазмы и разрушением монослоя [51].

Показано, что MPXV эффективно реплицируется в эпителиальных клетках дыхательных путей человека, кератиноцитах и дендритных клетках, что подтверждает важную роль слизистых оболочек и кожи в патогенезе инфекции [53]. Кроме того, клетки линий HaCaT и HeLa используются для изучения взаимодействия вируса с клетками эпителия и оценки клеточного иммунного ответа [48]. В ряде исследований установлено, что вирус способен подавлять сигнальные пути интерферонового ответа и ингибировать апоптоз инфицированных клеток, обеспечивая тем самым эффективную внутриклеточную репликацию [50].

Для изучения репродуктивной активности MPXV широко применяют методы анализа бляшкообразования, определения ТЦД₅₀, МТТ-тест, иммунофлуоресцентный анализ, полимеразную цепную реакцию в реальном времени и электронную микроскопию [48, 51]. Использование рекомбинантных штаммов MPXV, экспрессирующих флуоресцентные белки GFP и tdTomato, значительно упростило визуализацию вирусной репликации и проведение высокопроизводительного скрининга противовирусных соединений [54].

В исследованиях последних лет активно используют модели совместного культивирования иммунокомпетентных и эпителиальных клеток, а также трехмерные (3D) клеточные модели и органоиды, позволяющие более полно воспроизводить патогенез инфекции in vivo [52]. Такие модели применяют для изучения механизмов врожденного иммунного ответа, межклеточных взаимодействий и оценки эффективности противовирусных препаратов [49].

Дополнительные модели in vitro для изучения ортопоксвирусов

Помимо вирусов оспы обезьян, оспы верблюдов, оспы коров и вируса осповакцины, различные модели клеточных культур широко применяют при исследовании других представителей рода Orthopoxvirus, включая вирус натуральной оспы (VARV), вирус эктромелии (ECTV), вирусы оспы кроликов, оспы буйволов и тюленьей оспы [55]. Использование клеточных культур позволяет изучать репродуктивные свойства вирусов, механизмы взаимодействия вируса и клетки-хозяина, а также проводить оценку эффективности противовирусных препаратов и вакцинных кандидатов.

Для культивирования VARV исторически использовали клеточные линии Vero, HEp-2, FL, BSC-40, первичные культуры клеток эмбриона человека и куриного эмбриона [56]. Показано, что VARV способен эффективно реплицироваться в чувствительных клеточных системах с развитием выраженного цитопатического действия, характеризующегося округлением клеток, дегенерацией монослоя и образованием внутриклеточных включений [56]. В настоящее время исследования VARV строго ограничены специализированными лабораториями высокого уровня биобезопасности.

ECTV, являющийся возбудителем мышиной оспы, широко культивируется на клеточных линиях L929, BSC-1, Vero, NIH/3T3 и фибробластах эмбриона мыши [57–59]. Репродукция ECTV сопровождается выраженным цитопатическим действием и образованием характерных бляшек, что делает данный вирус удобной моделью для изучения молекулярных механизмов вирулентности ортопоксвирусов и оценки противовирусной активности соединений [57–59].

При исследовании вируса оспы кроликов используются культуры клеток RK-13, Vero и первичные культуры клеток почки кролика [60]. В данных клеточных системах вирус активно реплицируется с развитием цитопатического эффекта и формированием очагов деструкции монослоя. Модели in vitro на основе RK-13 широко применяют для изучения вирусной репликации и тестирования антивирусных препаратов [60].

Вирус оспы буйволов (Buffalopox virus), близкородственный VACV, культивируется преимущественно на клеточных линиях Vero, BHK-21 и фибробластах эмбриона теленка [61]. Установлено, что вирус обладает высокой репродуктивной активностью в культурах клеток почечного происхождения и вызывает выраженные дегенеративные изменения клеточного монослоя [61].

Кроме того, для изучения ортопоксвирусов активно используют рекомбинантные клеточные системы, экспрессирующие флуоресцентные или люминесцентные маркеры, позволяющие проводить мониторинг вирусной репликации в режиме реального времени [54]. В современных исследованиях все большее значение приобретают трехмерные клеточные культуры, органоиды кожи и дыхательных путей, а также модели совместного культивирования эпителиальных и иммунокомпетентных клеток [47]. Такие системы позволяют более полно воспроизводить особенности патогенеза ортопоксвирусных инфекций и оценивать механизмы врожденного иммунного ответа [49].

Культуры клеток остаются основным инструментом для первичного скрининга противовирусных препаратов против ортопоксвирусов. На различных моделях in vitro показана эффективность цидофовира, бринцидофовира, тековиримата и ряда экспериментальных соединений в отношении VACV, MPXV, CPXV и ECTV [62, 63]. Наглядная информация по использованию in vitro моделей использованных для изучения ортопоксвирусных инфекции показана в табл. 1.

 

Таблица 1. In vitro модели, использованные при изучении ортопоксвирусных инфекций.

Table 1. In vitro Experimental Models Employed in Orthopoxvirus Infection Research

Вирус Virus	Клеточные культуры / модели Cell cultures / models	Особенности репродукции и применения Reproductive characteristics and applications	Источник Source
1	2	3	4
Вирус оспы верблюдов Camelpox virus (CMLV)	Vero, MA-104, клетки почки макаки-резус, почки детеныша хомяка, Dubca, клетки тестикул и почки ягненка, клетки эмбриона верблюда, клетки почки теленка, фибробласты эмбриона цыпленка Vero cells, MA-104 cells, rhesus monkey kidney cells, BHK cells, Dubca cells, lamb testis and kidney cells, camel embryo cells, calf kidney cells, and chicken embryo fibroblasts (CEF)	Выраженное цитопатическое действие (ЦПД), накопление вируса до 7,62 lg ТЦД50/мл, использование для выделения эпизоотических и аттенуированных штаммов A pronounced cytopathic effect (CPE) was observed, with virus titers reaching up to 7.62 log TCID50/mL, enabling the isolation of both epizootic and attenuated strains.	[39–45]
Вирус оспы коров Cowpox virus (CPXV)	Почки ягненка, Vero, CV-1, HeLa, BSC-40, RK-13, HaCaT Lamb kidney cells, Vero, CV-1, HeLa, BSC-40, RK-13, HaCaT	Репликация сопровождается выраженным ЦПД; используется для изучения вирулентности, иммунного ответа и тестирования противовирусных препаратов Replication is accompanied by a pronounced cytopathic effect (CPE); used for studying virulence, immune responses, and testing antiviral drugs	[39, 44, 45, 47–50]
Вирус осповакцины Vaccinia virus (VACV)	CV-1, Vero, 4647, BSC-40, HeLa, RK-13, HaCaT	Используется для создания рекомбинантных штаммов, изучения генов вирулентности, тестирования вакцин и противовирусных средств Used for the generation of recombinant strains, the study of virulence genes, and testing of vaccines and antiviral agents	[40, 43–52]
Вирус оспы обезьян Monkeypox virus (MPXV)	Vero, Vero E6, Vero 76, LLC-MK2, MA-104, BSC-40, RK-13, CV-1, HeLa, HaCaT	Эффективная репликация в эпителиальных и иммунных клетках; выраженное ЦПД, образование синцитиев; применение для оценки вирулентности и скрининга препаратов Efficient replication in epithelial and immune cells; pronounced cytopathic effect (CPE) and syncytium formation; used for virulence assessment and drug screening	[48, 49, 51, 52, 54]
Вирус натуральной оспы Variola virus (VARV)	Vero, HEp-2, FL, BSC-40, клетки эмбриона человека и куриного эмбриона Vero, HEp-2, FL, BSC-40, human embryo cells and chick embryo cells	Репликация сопровождается дегенерацией монослоя и образованием внутриклеточных включений; исследования проводятся только в BSL-4 лабораториях Replication is accompanied by monolayer degeneration and the formation of intracellular inclusion bodies; studies are conducted only in BSL-4 laboratories	[56]
Вирус эктромелии Ectromelia virus (ECTV)	L929, BSC-1, Vero, NIH/3T3, фибробласты эмбриона мыши L929, BSC-1, Vero, NIH/3T3, mouse embryo fibroblasts	Образование характерных бляшек и выраженный ЦПД; модель для изучения вирулентности ортопоксвирусов Formation of characteristic plaques and pronounced cytopathic effect (CPE); a model for studying orthopoxvirus virulence	[54, 58, 59]
Вирус оспы кроликов Rabbitpox virus	RK-13, Vero, первичные клетки почки кролика RK-13, Vero, primary rabbit kidney cells	Активная репликация с формированием очагов деструкции монослоя; используется для тестирования антивирусных препаратов Active replication with the formation of areas of monolayer destruction; used for antiviral drug testing	[60]
Вирус оспы буйволов Buffalopox virus (BPXV)	Vero, BHK-21, фибробласты эмбриона теленка Vero, BHK-21, calf embryo fibroblasts	Высокая репродуктивная активность в клетках почечного происхождения, выраженные дегенеративные изменения монослоя High replicative activity in kidney-derived cells with pronounced degenerative changes in the monolayer	[61]
Современные 3D-модели и органоиды Modern 3D models and organoids	Органоиды кожи и дыхательных путей, кокультуры эпителиальных и иммунных клеток Skin and respiratory tract organoids, co-cultures of epithelial and immune cells	Моделирование патогенеза in vivo, изучение врожденного иммунного ответа и межклеточных взаимодействий Used for modeling in vivo pathogenesis, studying innate immune responses, and intercellular interactions	[49, 52]
Рекомбинантные клеточные системы Recombinant cell systems	Клетки с GFP-, tdTomato- и люминесцентными маркерами Cells expressing GFP, tdTomato, and luminescent markers	Мониторинг репликации вируса в режиме реального времени, высокопроизводительный скрининг препаратов Enable real-time monitoring of viral replication and high-throughput drug screening	[54]
Модели для оценки противовирусных препаратов Models for antiviral drug evaluation	VACV, MPXV, CPXV, ECTV на различных клеточных линиях VACV, MPXV, CPXV, ECTV across various cell lines	Используются для тестирования цидофовира, бринцидофовира, тековиримата и экспериментальных соединений Used for testing cidofovir, brincidofovir, tecovirimat, and experimental compounds	[51, 63]

 

Модели in vivo

Исследования, направленные на разработку противовирусных препаратов, часто начинаются с in vitro систем, но затем переходят к in vivo моделям, где оцениваются фармакокинетика, фармакодинамика и клиническая эффективность препарата. Особое внимание уделяют выбору модели, которая будет наилучшим образом коррелировать с наблюдаемыми у человека эффектами, учитывая при этом видоспецифичность взаимодействия вирус–хозяин. Изучение ортопоксвирусов требует использования адекватных in vivo моделей, способных воспроизводить патогенез, клинические проявления и иммунный ответ, сходные с таковыми у человека. Выбор модели определяется задачами исследования, такими как изучение патогенеза, механизмов передачи инфекции, тестирование вакцин и противовирусных препаратов [64, 65]. Современные обзоры подчеркивают, что ни одна модель не является универсальной, и оптимальный подход заключается в комбинированном использовании нескольких видов животных для получения наиболее полной картины инфекции [66].

Приматы (non-human primates)

Нечеловекообразные приматы являются наиболее релевантной экспериментальной моделью для изучения ортопоксвирусных инфекций благодаря их высокой генетической, иммунологической и физиологической близости к человеку. Эти модели максимально точно воспроизводят клиническое течение заболевания, что делает их «золотым стандартом» в доклинических исследованиях [66, 67].

Наиболее часто объектами экспериментов являются макака cynomolgus (Macaca fascicularis), а также макаки-резус (Macaca mulatta). При инфицировании MPXV у данных животных развиваются симптомы, схожие с таковыми у человека: отмечаются лихорадка, выраженная интоксикация, кожные высыпания (макуло-папулезные и пустулезные элементы), лимфаденопатия, а также поражение дыхательной системы [68]. В тяжелых случаях наблюдается генерализованная инфекция с высокой летальностью, особенно при аэрозольном пути заражения [68].

Инкубационный период и динамика клинических проявлений у приматов близки к таковым у человека, что позволяет детально изучать патогенез инфекции, включая стадии вирусемии, диссеминацию вируса и поражение органов-мишеней [64]. Кроме того, у приматов воспроизводится характерный иммунный ответ, включающий как врожденные, так и адаптивные механизмы защиты [69].

Данные модели широко применяются для: оценки эффективности и безопасности вакцин; тестирования противовирусных препаратов; изучения путей передачи инфекции, включая аэрозольный механизм; анализа иммунопатогенеза и механизмов уклонения вируса от иммунного ответа [65, 66, 69].

Несмотря на высокую информативность, использование нечеловекообразных приматов связано с рядом ограничений: высокой стоимостью содержания, строгими этическими требованиями, необходимостью работы в условиях повышенного уровня биобезопасности (BSL-3/BSL-4), а также ограниченной доступностью животных [65].

Луговые собачки (Cynomys ludovicianus)

Луговые собачки считаются одной из наиболее адекватных и клинически релевантных моделей для воспроизведения инфекции, вызываемой MPXV. Их чувствительность к вирусу и характер течения заболевания во многом сходны с таковыми у человека, что делает данную модель особенно ценной для экспериментальных исследований [65, 70].

У инфицированных животных наблюдается инкубационный период, сопоставимый с таковым у человека (в среднем 10–13 сут), после чего развиваются типичные клинические проявления. К ним относятся кожные высыпания (папулы, пустулы), потеря массы тела, угнетение общего состояния, а также поражение слизистых оболочек и дыхательных путей [60, 70, 71]. В ряде случаев заболевание может прогрессировать до тяжелых форм с системным вовлечением органов [60].

Особую значимость данная модель приобрела после вспышки оспы обезьян в США в 2003 г., когда луговые собачки выступили промежуточным хозяином, передав вирус человеку. Это подтвердило их высокую восприимчивость и эпидемиологическую значимость как модели зоонозной передачи инфекции [67].

Модель луговых собачек позволяет изучать патогенез и клиническое течение инфекции, включая стадии развития кожных поражений и системного ответа организма [60, 70], а также механизмы передачи вируса, в том числе аэрогенный путь [67].

Помимо этого, на модели луговых собачек изучают эффективность вакцин и противовирусных препаратов в условиях, максимально приближенных к естественной инфекции [65, 70].

Кроме того, у этих животных воспроизводится как локальная, так и генерализованная форма инфекции, что дает возможность оценивать различные аспекты иммунного ответа, включая гуморальный и клеточный иммунитет [65].

Несмотря на высокую информативность, использование луговых собачек ограничено рядом факторов: сложностью содержания, ограниченной доступностью лабораторных линий, а также меньшей степенью стандартизации по сравнению с классическими лабораторными животными, такими как мыши [65].

Кролики (Oryctolagus cuniculus)

Кролики используются как дополнительная модель для изучения ортопоксвирусных инфекций, однако их восприимчивость к большинству ортопоксвирусов, включая MPXV, остается ограниченной [65, 72]. Взрослые животные, как правило, демонстрируют высокую устойчивость к инфекции, что проявляется отсутствием выраженных клинических признаков или развитием лишь локальных реакций в месте инокуляции [65].

В то же время новые данные показывают, что определенные штаммы вируса (например, Clade IIb) способны вызывать у кроликов более выраженную клиническую картину, включая кожные поражения и системные проявления, что расширяет потенциал данной модели [71].

Новорожденные кролики значительно более чувствительны к инфекции. У них возможно развитие генерализованных форм заболевания с высокой летальностью, что связано с незрелостью иммунной системы [72]. Это делает данные модели потенциально полезными для изучения механизмов вирулентности и ранних этапов взаимодействия вируса с организмом хозяина [65].

При использовании нетипичных путей заражения, таких как внутримозговое (интроцеребральное) введение вируса, у кроликов развивается тяжелая инфекция с поражением центральной нервной системы (ЦНС). В таких случаях наблюдаются выраженные неврологические симптомы, включая судороги, параличи и быструю гибель животных [73]. Данная модель применяется для оценки нейротропности вируса и изучения механизмов вирусного поражения ЦНС [73].

Кроме того, кроликов исторически использовали для изучения родственных ортопоксвирусов, таких как VACV и вирус осповакцины кроликов (rabbitpox), который вызывает у них более выраженное заболевание и служит удобной моделью генерализованной инфекции [65, 73]. Это позволяет проводить сравнительные исследования патогенеза и иммунного ответа между разными представителями рода Orthopoxvirus [59, 65].

Несмотря на отдельные преимущества, использование кроликов ограничено из-за их низкой естественной чувствительности к большинству клинически значимых ортопоксвирусов и меньшей воспроизводимости результатов по сравнению с мышиными моделями [65, 72].

Мыши (Mus musculus)

Мыши являются одной из наиболее доступных и хорошо изученных лабораторных моделей в вирусологии. Они широко применяются для исследования патогенеза ортопоксвирусов, включая ECTV (mousepox), VACV и MPXV. Использование мышей обусловлено наличием хорошо охарактеризованных линий, возможностью генетических модификаций и детально изученной иммунной системой [65, 74, 75].

У новорожденных, а также у иммунокомпрометированных животных (например, с дефицитом Т- или В-клеточного звена иммунитета) развивается генерализованная инфекция с высокой летальностью. Это делает модель особенно ценной для изучения вирулентности вирусов, механизмов уклонения от иммунного ответа и оценки эффективности противовирусных препаратов и вакцин [59, 72, 73].

Кроме того, мышиная модель позволяет исследовать врожденный и адаптивный иммунитет, включая роль интерферонов, NK-клеток и цитотоксических Т-лимфоцитов в контроле инфекции [73]. ECTV, являясь естественным патогеном мышей, служит классической моделью для изучения системной ортопоксвирусной инфекции, так как воспроизводит многие аспекты патогенеза натуральной оспы у человека [59, 75].

Несмотря на многочисленные преимущества, следует учитывать ограничения модели: некоторые ортопоксвирусы (например, VARV) не вызывают у мышей типичной инфекции без предварительной адаптации, что может ограничивать проецирование результатов на человека [53, 65, 72, 76].

Альтернативные модели (белки, другие дикие грызуны)

Некоторые виды диких грызунов, включая белок, гамбийских крыс и других представителей африканской фауны, рассматриваются как потенциальные резервуарные хозяева ортопоксвирусов, в частности MPXV. Эти животные играют важную роль в поддержании естественных циклов циркуляции вируса в природе и его передаче между видами, включая человека [66, 76–78].

Экспериментальные и эпидемиологические исследования показали, что отдельные виды белок (например, род Funisciurus) и африканские гигантские крысы способны инфицироваться MPXV с развитием клинических признаков, включая кожные высыпания, респираторные симптомы и вирусемию. В некоторых случаях инфекция протекает с достаточной выраженностью, что делает этих животных более релевантной моделью по сравнению с традиционными лабораторными грызунами для изучения природного патогенеза [66, 72].

Особое внимание к данным видам было привлечено также после вспышки оспы обезьян в США в 2003 г., связанной с импортом инфицированных африканских грызунов (включая гамбийских крыс), которые передали вирус прерийным собачкам, а затем человеку. Этот случай подтвердил роль диких грызунов как ключевого звена в эпидемиологии инфекции [67].

Дополнительно в последние годы ведутся исследования по созданию новых экспериментальных моделей среди нетрадиционных видов животных, включая сонь (dormice), для которых показана восприимчивость к MPXV и возможность воспроизведения элементов патогенеза инфекции [79].

Несмотря на высокую биологическую релевантность, использование таких моделей существенно ограничено. Основные трудности включают отсутствие стандартизированных линий животных, генетическую вариабельность, сложность содержания в лабораторных условиях, а также биобезопасные и этические ограничения. Кроме того, ограниченная доступность реагентов и инструментов для иммунологического анализа у этих видов, затрудняет глубокое изучение механизмов иммунного ответа [72].

В связи с этим дикие грызуны чаще используются в полевых и эпидемиологических исследованиях, направленных на выявление природных резервуаров, путей передачи и факторов, влияющих на поддержание вируса в экосистемах, тогда как в лабораторных условиях предпочтение отдается более стандартизированным моделям [78].

Сравнительная характеристика in vivo моделей использованных для изучения ортопоксвирусных инфекции показана в табл. 2.

 

Таблица 2. Сравнительная характеристика in vivo моделей ортопоксвирусных инфекции

Table 2. Comparative Analysis of in vivo Models Used in Orthopoxvirus Infection Research

Модель Model	Вид животного Animal species	Восприимчивость / течение инфекции Susceptibility / disease progression	Основные области применения Main areas of application	Преимущества Advantages	Ограничения Limitations	Литература Source
1	2	3	4	5	6	7
Приматы Non-human primates (NHP)	Макаки Macaques (Macaca fascicularis, Macaca mulatta)	Течение максимально приближено к человеку: лихорадка, высыпания, лимфаденопатия, респираторные симптомы; возможна высокая летальность Disease course closely resembles that in humans: fever, rash, lymphadenopathy, respiratory symptoms; possible high lethality	Патогенез, вакцины, противовирусные препараты, передача инфекции Used for pathogenesis studies, vaccine development, antiviral drug evaluation, and transmission research	«Золотой стандарт», высокая релевантность Considered the «gold standard» model with high translational relevance	Высокая стоимость, этика, BSL-3/4 limitations include high cost, ethical constraints, and requirement for BSL-3/4 containment	[64–68, 76]
Луговые собачки Prairie dogs	Cynomys ludovicianus	Инкубация 10–13 сут; кожные поражения, потеря массы, системная инфекция Incubation period 10–13 days; skin lesions, weight loss, systemic infection	Патогенез, передача, тестирование терапии и вакцин Used for studies of pathogenesis, transmission, and evaluation of therapeutics and vaccines	Хорошо моделируют зоонозные инфекции Effectively model zoonotic infections	Ограниченная доступность, слабая стандартизация Limitations include limited availability and poor standardization	[67–73]
Кролики Rabbits	Oryctolagus cuniculus	Взрослые устойчивы; у новорожденных – тяжелая генерализованная инфекция; при i.c. заражении – нейроинфекция; для Clade IIb возможны более выраженные клинические проявления Adults are resistant; in neonates, severe generalized infection; after intracerebral (i.c.) inoculation, neuroinfection develops; for Clade IIb, more pronounced clinical manifestations are possible	Вирулентность, нейротропность, сравнительные исследования (VACV, rabbitpox) Used for studies of virulence, neurotropism, and comparative analyses (VACV, rabbitpox)	Подходят для специфических задач Suitable for specific experimental purposes	Низкая естественная чувствительность Low natural susceptibility	[58, 71–73, 79]
Мыши Mice	Mus musculus	У новорожденных и иммунодефицитных – тяжелая инфекция; модель mousepox (эктромелия) In neonates and immunodeficient animals, severe infection develops; mousepox (ectromelia) serves as a model	Иммунитет, патогенез, вакцины, генетические исследования Used for studies of immunity, pathogenesis, vaccine development, and genetic research	Доступность, генетические линии Availability and well-characterized genetic lines	Не все вирусы инфицируют без адаптации Not all viruses infect without adaptation	[58, 67, 71, 73, 74, 78]
Альтернативные грызуны Alternative rodents	Белки (Funisciurus), гамбийские крысы и др. Squirrels (Funisciurus spp.), Gambian pouched rats, and others	Возможна клинически выраженная инфекция: высыпания, вирусемия, респираторные симптомы May develop clinically apparent infection including rash, viremia, and respiratory symptoms	Эпидемиология, резервуары, природный патогенез Epidemiological studies, reservoir identification, and investigation of natural pathogenesis	Высокая биологическая релевантность High biological relevance	Нет стандартизации, сложность содержания Lack of standardization and difficult maintenance	[70, 75–78]

 

Сравнение и применение моделей

Одним из ключевых преимуществ in vitro моделей является их высокая гибкость и воспроизводимость экспериментальных условий. Варьирование типов клеточных культур позволяет моделировать различные сценарии вирусной инфекции и оценивать эффективность противовирусных препаратов в отношении широкого спектра ортопоксвирусов [5, 10]. Это приобретает особую актуальность в контексте сохраняющейся угрозы, связанной с такими патогенами, как VARV и MPXV [7, 20].

Кроме того, in vitro системы играют критически важную роль на ранних этапах разработки лекарственных средств. Высокопроизводительный скрининг с использованием клеточных культур обеспечивает быструю идентификацию соединений с потенциальной противовирусной активностью [5]. Данный этап предшествует более сложным и затратным исследованиям in vivo, повышая общую эффективность и экономическую целесообразность разработки терапевтических агентов [3].

В то же время полноценное изучение ортопоксвирусных инфекций требует применения адекватных in vivo моделей, способных воспроизводить патогенез, клинические проявления и иммунный ответ, приближенные к человеческим [29, 66]. Выбор конкретной модели определяется задачами исследования, включая изучение патогенеза, механизмов передачи инфекции, а также оценку эффективности вакцин и противовирусных препаратов [76].

Традиционно в качестве in vivo моделей широко используются лабораторные животные, включая мышей, крыс, кроликов и приматов [76]. Мыши являются наиболее распространенными модельными организмами благодаря доступности, короткому репродуктивному циклу и широким возможностям генетической модификации [59, 75]. Различные линии мышей демонстрируют вариабельную восприимчивость к ортопоксвирусам, что позволяет моделировать как острые, так и субклинические формы инфекции [72]. Например, иммунокомпетентные мыши линии BALB/c используются для изучения острых инфекций, тогда как иммунодефицитные (SCID) или генетически модифицированные модели применяются для анализа роли отдельных компонентов иммунной системы [65].

Кролики применяются преимущественно для изучения кожных проявлений инфекции, поскольку индуцируемые поражения напоминают клиническую картину натуральной оспы у человека [71, 73]. Их сравнительно крупные размеры и физиологическое сходство с человеком также делают их удобными для оценки системных эффектов и тестирования вакцин [73].

Приматы, несмотря на высокую стоимость и этические ограничения, представляют собой наиболее релевантную модель для изучения ортопоксвирусных инфекций, так как наиболее полно воспроизводят клинические и иммунологические особенности заболевания у человека [64, 68].

Существуют и специализированные модели, используемые для изучения контагиозности и путей передачи вируса, включая модели с участием животных, имитирующих тесный контакт между особями [75, 78]. Разработка противовирусных препаратов обычно начинается с in vitro экспериментов, после чего переходит к in vivo исследованиям, где оцениваются фармакокинетические и фармакодинамические параметры, а также клиническая эффективность [5].

Особое значение имеет выбор модели, наиболее адекватно отражающей взаимодействие «вирус–хозяин», с учетом видоспецифичности иммунных реакций [6, 31]. В табл. 3 показан сравнительный анализ in vitro и in vivo моделей по вышеперечисленным критериям.

 

Таблица 3. Сравнительный анализ моделей

Table 3. Comparative Analysis of Experimental Models

Критерий Criterion	In vitro	In vivo
1	2	3
Контроль условий Control of conditions	Высокий High	Ограниченный Limited
Физиологическая релевантность Physiological relevance	Низкая–средняя Low–moderate	Высокая High
Иммунный ответ Immune response	Ограничен Limited	Полный Complete
Стоимость Cost	Низкая Low	Высокая High
Основное применение Primary application	Скрининг, молекулярные исследования Screening, molecular studies	Патогенез, терапия, вакцины Pathogenesis, therapy, vaccines

 

Несмотря на значительные достижения, существующие модели имеют ряд ограничений, такие как: отсутствие универсальной модели, полностью воспроизводящей инфекцию натуральной оспы у человека [29, 64, 66]; межвидовые различия, влияющие на иммунный ответ и течение заболевания [6, 31]; необходимость соблюдения высоких уровней биологической безопасности (BSL-3/BSL-4) при работе с патогенами [28].

Заключение

Ортопоксвирусы продолжают сохранять высокую актуальность как для фундаментальной вирусологии, так и для практического здравоохранения и ветеринарии. Несмотря на ликвидацию натуральной оспы, представители рода Orthopoxvirus остаются значимыми возбудителями зоонозных инфекций, способными вызывать заболевания у человека и животных. Рост числа вспышек оспы обезьян, оспы верблюдов, коровьей оспы и других ортопоксвирусных инфекций в разных регионах мира свидетельствует о сохраняющемся эпидемиологическом потенциале данной группы вирусов и необходимости дальнейшего углубленного изучения их биологических свойств, механизмов патогенеза и межвидовой передачи.

Проведенный анализ показал, что современные экспериментальные модели являются основой изучения ортопоксвирусных инфекций. Модели in vitro позволяют исследовать молекулярные и клеточные механизмы репликации вирусов, особенности цитопатического действия, взаимодействие вируса с клеткой-хозяином, а также проводить первичный скрининг противовирусных препаратов и вакцинных кандидатов. Использование различных клеточных линий, включая Vero, RK-13, CV-1, BSC-40, HeLa, HaCaT и др., обеспечивает возможность изучения широкого спектра ортопоксвирусов, включая вирусы оспы обезьян, коровьей оспы, вакцинии, эктромелии и оспы верблюдов. Особую перспективу представляют современные 3D-культуры, органоиды и модели совместного культивирования иммунных и эпителиальных клеток, позволяющие более полно воспроизводить особенности инфекции in vivo.

В то же время исключительно in vitro системы не способны полностью отражать сложность взаимодействия вируса с организмом хозяина. В связи с этим ключевое значение сохраняют модели in vivo, позволяющие изучать патогенез инфекции, особенности иммунного ответа, механизмы передачи вируса, а также оценивать эффективность и безопасность противовирусных препаратов и вакцин. Наиболее релевантными моделями считаются нечеловекообразные приматы, у которых заболевание протекает максимально близко к инфекции человека. Однако высокая стоимость, этические ограничения и необходимость работы в условиях повышенного уровня биологической безопасности существенно ограничивают их использование.

Мышиные модели остаются наиболее распространенными благодаря доступности, высокой степени стандартизации и широким возможностям генетической модификации. Вирус эктромелии служит важной моделью системной ортопоксвирусной инфекции, позволяя изучать механизмы врожденного и адаптивного иммунитета. Дополнительное значение имеют модели на кроликах, луговых собачках и диких грызунах, которые позволяют исследовать отдельные аспекты патогенеза, нейротропности и межвидовой передачи вирусов.

Сравнительный анализ показал, что ни одна из существующих моделей не является универсальной и не способна полностью воспроизвести все особенности ортопоксвирусной инфекции у человека. Каждая экспериментальная система обладает собственными преимуществами и ограничениями, что определяет необходимость комплексного подхода с комбинированным использованием различных моделей. Наиболее эффективной стратегией является последовательное применение in vitro и in vivo систем, позволяющее сочетать высокую воспроизводимость лабораторных исследований с физиологической релевантностью животных моделей.

Таким образом, дальнейшее совершенствование экспериментальных моделей ортопоксвирусных инфекций, внедрение современных клеточных технологий, органоидных систем и генетически модифицированных животных будет способствовать более глубокому пониманию механизмов патогенеза ортопоксвирусов, разработке эффективных средств специфической профилактики и терапии, а также повышению готовности к возможным новым вспышкам зоонозных ортопоксвирусных инфекций.

 

¹ ICTV 9th Report. Poxviridae [Электронный ресурс]. 2011. URL: https://ictv.global/report_9th/dsDNA/poxviridae (дата обращения: 20.08.2026).

About the authors

Sanat S. Kilibayev

Research Institute for Biological Safety Problems

Email: s.kilibayev@biosafety.kz
ORCID iD: 0000-0001-9203-2189

PhD, Head of the Microorganism Collection Laboratory

Kazakhstan, 080409, Gvardeisky

Moldir S. Tuyskanova

Research Institute for Biological Safety Problems

Author for correspondence.
Email: m.serzhankyzy@biosafety.kz
ORCID iD: 0000-0001-6565-082X

PhD, Researcher, Microorganism Collection Laboratory

Kazakhstan, 080409, Gvardeisky

Moldyr A. Azanbekova

Research Institute for Biological Safety Problems

Email: azanbekova.m@biosafety.kz
ORCID iD: 0000-0002-5807-7604

PhD, Senior Researcher, Microorganism Collection Laboratory

Kazakhstan, 080409, Gvardeisky

Kuandyk D. Zhugunissov

Research Institute for Biological Safety Problems

Email: k.zhugunisov@biosafety.kz
ORCID iD: 0000-0003-4238-5116

PhD, Director General

Kazakhstan, 080409, Gvardeisky

References

Supplementary files