Molecular characterization of a rare rotavirus (Sedoreoviridae: Rotavirus) strain genotype G2P[9] isolated from a child with acute gastroenteritis

Full Text

Введение

Ротавирус А (РВА, Rotavirus А, род Rotavirus, семейство Sedoreoviridae) представляет собой глобальную проблему здравоохранения, признанную ведущей причиной тяжелой дегидратирующей диареи и смертности детей в возрасте до 5 лет. В 2019 г. РВА стал причиной примерно 19% всех смертей, связанных с диареей, что составило более 235 тыс. летальных исходов во всем мире. Наибольшая нагрузка приходится на регионы с неблагоприятными условиями жизни и низким уровнем дохода, такие как Африка, Океания и Южная Азия, где наблюдаются плохие санитарные условия и ограничен доступ к чистой питьевой воде [1]. В России ротавирусы (РВ) ежегодно вызывают зимне-весенний подъем заболеваемости острым гастроэнтеритом (ОГЭ). В 2024 г. ротавирусная инфекция (РВИ) составила более трети случаев (36,82%) острой кишечной инфекции (ОКИ) установленной этиологии, при этом показатель заболеваемости РВИ составил 63,14 на 100 тыс. населения и оставался несколько ниже среднемноголетнего уровня (73,95 на 100 тыс.) [2]. Несмотря на значительный прогресс в вакцинопрофилактике за последние десятилетия и заметное снижение показателей смертности, РВА продолжает представлять серьезную угрозу для уязвимых групп населения.

Существует несколько механизмов, обеспечивающих высокую степень изменчивости РВ и приводящих к их генетическому разнообразию, среди которых ключевыми являются реассортация и антигенный дрейф – процессы, принципиально различающиеся по своей природе и масштабу изменений.

Способность РВ к реассортации обусловлена их сегментированным геномом, состоящим из 11 сегментов двунитевой РНК. При инфицировании клетки одновременно двумя или более штаммами происходит обмен сегментами, что приводит к появлению изолятов с новыми комбинациями генов и потенциально новыми фенотипическими свойствами. Этот процесс не является строго ген-специфичным и может затрагивать любые из 11 сегментов генома независимо от его функции и локализации [3].

Несмотря на это, не все комбинации генов оказываются одинаково жизнеспособными. В ходе эволюции сформировались устойчивые констелляции генотипов. Так, наиболее распространенные в мире генотипы G1, G3, G4, G9, G12 и P[8] обычно ассоциируются с первой или Wa-подобной геногруппой (G1/G3/G4/G9-P[8]-I1-R1-C1-M1-A1-N1-T1-E1-H1). Они имеют внутренние гены первого генотипа, «длинный» электрофоретип (ЭФ-тип) РНК и отдаленное родство с РВ свиней. Штаммы генотипа G2P[4], в свою очередь, относятся ко второй или DS-1-подобной геногруппе (G2-P[4]-I2-R2-C2-M2-A2-N2-T2-E2-H2). Для них характерны внутренние гены второго генотипа, «короткий» ЭФ-тип РНК и эволюционная связь с РВ крупного рогатого скота [4]. Третья, AU-1-подобная геногруппа, является минорной и включает РВА генотипов G3P[3] и G3P[9] (G3-P[3]/P[9]-I3-R3-C3-M3-A3-N3-T3-E3-H3), которые имеют внутренние гены третьего генотипа, «широкий ЭФ-тип и отдаленное родство с РВ кошек и собак [5, 6].

Эти три геногруппы являются основой для формирования межгрупповых реассортантных вариантов. Ранее считалось, что реассортантное вирусное потомство менее жизнеспособно, чем типичные родительские варианты, так как последние имеют устойчивые консервативные геномные констелляции [7, 8]. Однако в настоящее время в мире все чаще фиксируют возникновение и широкое распространение новых реассортантных штаммов РВА, несущих генетический материал сразу нескольких геногрупп, что придает им особую эпидемиологическую значимость [9–12].

Помимо этого, РВА с чистым AU-1-подобным профилем у людей встречаются крайне редко, куда чаще выявляются реассортантные варианты, содержащие гены нескольких геногрупп, которые объединяют в подгруппы Cat97 и BA222 [13, 14].

Особую роль в формировании новых реассортантных вариантов играют животные. Крупный рогатый скот, свиньи, лошади, кошки, собаки служат резервуаром РВ, способных обмениваться генетическим материалом с РВА человека. Так, например, генотипы G6, G8 и G10 чаще встречаются у РВ животных, но иногда выявляются и у РВА человека, указывая на зоонозный потенциал и возможность межвидовой передачи [15–17].

В связи с этим определение полного генотипа РВА, учитывающего все 11 сегментов, приобретает особую значимость. Традиционная бинарная классификация, основанная только на генах VP7 (G-генотип) и VP4 (P-генотип), не позволяет выявить реассортанты с измененными внутренними генами. Анализ полного генотипа, напротив, дает возможность идентифицировать смешанные наборы генов разных геногрупп, установить их происхождение и отслеживать динамику генетического разнообразия РВ, включая штаммы, возникшие в результате межвидовой передачи.

Антигенный дрейф представляет собой принципиально иной механизм изменчивости, при котором происходит постепенное накопление точечных мутаций в геноме вируса, преимущественно в генах, кодирующих поверхностные белки VP4 и VP7. Эти мутации возникают из-за ошибок РНК-полимеразы, не обладающей репаративной активностью, и приводят к изменениям аминокислотных последовательностей, модифицируя антигенные эпитопы. В результате вирус может уклоняться от распознавания нейтрализующими антителами, что способствует развитию устойчивости к иммунитету. Хотя мутации накапливаются относительно медленно, со временем они вызывают постепенное изменение антигенного профиля вируса, поддерживая циклические подъемы заболеваемости [3].

Таким образом, сочетание реассортации и антигенного дрейфа формирует сложное генетическое разнообразие РВ. Молекулярный мониторинг с определением полного генотипа не только помогает выявлять редкие и реассортантные штаммы, но и раскрывает механизмы их происхождения. Эти данные критически важны для мониторинга эпидемически значимых вариантов, прогнозирования эпидемической ситуации, оценки эффективности вакцин и своевременной оптимизации вакцинопрофилактики, особенно в условиях появления новых вариантов.

В предыдущих работах нами была получена информация о разнообразии констелляций полных генотипов и дана молекулярно-генетическая характеристика РВА подгруппы ВА222 генотипов G2P[4], G3P[9] и G6P[9], подобных РВ кошек и собак, циркулировавших в Нижнем Новгороде в период 2016–2022 гг. [18, 19]. В настоящем исследовании в ходе изучения популяции РВА на территории Нижнего Новгорода в сезон 2022–2023 гг. был выявлен штамм с редким генотипом G2P[9]. Данный изолят, вероятно, так же, как и изученные нами ранее РВА, был представителем подгруппы ВА222.

Цель исследования – характеристика выявленного необычного штамма на основе полного генотипа и сравнение его с ранее охарактеризованными нижегородскими представителями подгруппы ВА222.

Материалы и методы

Клинические образцы. В период 2022–2023 гг. было исследовано 1303 образца стула детей, госпитализированных в детский инфекционный стационар Нижнего Новгорода с симптомами ОГЭ. Исследование проводилось при добровольном информированном согласии пациентов. Протокол исследования одобрен Локальным этическим комитетом ФБУН «Нижегородский НИИ эпидемиологии и микробиологии им. академика И.Н. Блохиной» Федеральной службы по надзору в сфере защиты прав потребителей и благополучия человека (Роспотребнадзор) (Протокол № 4 от 24.03.2021).

Экстракция и обнаружение ротавирусной РНК. Выделение РНК и постановку полимеразной цепной реакции с обратной транскрипцией (ОТ-ПЦР) проводили с использованием коммерческих наборов реагентов «РИБО-преп» и «РЕВЕРТА-L» (ЦНИИЭ, Россия). Обнаружение ротавирусной РНК проводили в режиме реального времени с помощью ПЦР-тест-системы «АмплиСенс Rotavirus/Norovirus/Astrovirus FL» (ЦНИИЭ, Россия).

Генотипирование. Определение G- и P-генотипов осуществляли методом мультиплексной ПЦР с использованием набора праймеров, типоспецифичных в отношении генотипов G1–G4, G6, G8, G9, G12, P[4], P[6], P[8] и P[9], опубликованных ранее [20, 21] и модифицированных нами с учетом нуклеотидных замен в местных штаммах, накопившихся с течением времени [22].

Штамм для настоящего исследования был отобран на основании результатов предварительного анализа электрофоретипов РНК РВА методом электрофореза в полиакриламидном геле (РНК-ПААГ) [22].

Нуклеотидные последовательности штамма депонированы в базы данных GenBank (Номера доступа: OR474407, OR474445, PX254155, PX254181, PX254207, PX254215, PX254259, PX254285, PX254311, PX254337, PX254363) и VGARus (Номера доступа: niie008648-niie008658).

Секвенирование нуклеотидных последовательностей. Для каждого гена исследуемого штамма был амплифицирован один фрагмент комплементарной ДНК с помощью праймеров, опубликованных ранее [23]. Секвенирование проводили по двум цепям на приборе «Нанофор 05» (ИАП РАН, Россия) с применением набора реагентов BigDye Terminator v. 3.1 (Thermo Fisher Scientific, США). Длина полученных нуклеотидных последовательностей варьировала от 632 до 879 пар нуклеотидов.

Анализ нуклеотидных и аминокислотных последовательностей. Поиск родственных последовательностей и определение генотипа для каждого гена выполняли с использованием онлайн-сервиса BLAST. Выравнивание и последующий анализ нуклеотидных и аминокислотных последовательностей проводили в программном обеспечении MEGA X.

Филогенетический анализ. Для проведения филогенетического анализа из международной базы данных GenBank были взяты нуклеотидные последовательности 11 генов РВА из разных стран, в том числе из России (Новосибирск, Омск), а также последовательности из Нижнего Новгорода, полученные ранее. Филогенетические деревья строили методом максимального правдоподобия (Maximum Likelihood) [24, 25]. Оценку достоверности построенных ветвей выполняли с использованием Bootstrap-анализа на основе 1000 репликаций. Проценты сходства нуклеотидных последовательностей были рассчитаны методом попарных дистанций (Pairwise Distances). Принадлежность изучаемых штаммов к филогенетическим линиям и сублиниям определяли на основе наличия устойчивых кластеров с индексом поддержки узла не ниже 75, а также высокого уровня сходства нуклеотидных последовательностей (в пределах 98,5–100,0%). Филогенетические линии и сублинии обозначали согласно принятой в литературе классификации [19, 23, 26–30].

Результаты

Типирование РВА методами ПЦР, РНК-ПААГ и частичного секвенирования. В ходе изучения РВА, циркулировавших в Нижнем Новгороде в период 2022–2023 гг., методами ПЦР-типирования и РНК-ПААГ был выявлен один штамм с редким генотипом G2P[9] (NN21/23), который демонстрировал «широкий» (AU-1-подобный) электрофоретический профиль (рис. 1).

 

Рис. 1. Профили миграции сегментов РНК штаммов РВА, изолированных на территории Нижнего Новгорода в сезон 2022–2023 гг.

Образец 1 – DS-1-подобные штаммы. Образец 2 – штамм NN21/23 с «широким» ЭФ-типом РНК, проанализированный в данной работе. Образец 3 – Wa-подобные штаммы. * – отмечены низкая скорость миграции 5-го сегмента и высокая мобильность 6-го и 11-го сегментов.

Fig. 1. Migration profiles of RNA segments of rotavirus strains isolated in Nizhny Novgorod during the 2022–2023 season.

Sample 1 – DS-1-like strains. Sample 2 – strain NN21/23 with a "broad" RNA electrophoresis, analyzed in this study. Sample 3 – Wa-like strains. * – low migration rate of the 5th segment and high mobility of the 6th and 11th segments.

 

Характерной особенностью данного профиля является низкая скорость миграции 5-го сегмента и высокая мобильность 6-го и 11-го сегментов.

Стоит отметить, что данный изолят был получен от ребенка мужского пола в возрасте 2 лет, проживающего на территории Нижнего Новгорода.

Штамм был секвенирован по всем генам (VP1–VP4, VP6, VP7, NSP1–NSP5/6), что позволило установить его полный генотип: G2-P[9]-I2-R2-C2-M2-A3-N2-T3-E3-H3. Показан смешанный набор генов DS-1-подобной (генотип 2) и AU-1-подобной (генотип 3) геногрупп, что свидетельствует о реассортантном происхождении данного изолята.

Филогенетический анализ. Для изучения внутригенотипового разнообразия на уровне линий и сублиний выявленного изолята был проведен филогенетический анализ по каждому из 11 генов. В анализ также были взяты ранее изученные ВА222-подобные РВА генотипов G2P[4], G3P[9] и G6P[9], выявленные в Нижнем Новгороде в период 2016–2022 гг. Адаптированные и сокращенные филогенетические деревья показаны на рис. 2.

 

Рис. 2. Филогенетические деревья, построенные на основе нуклеотидных последовательностей: a – структурных генов (VP1–VP4, VP6, VP7); б – неструктурных генов (NSP1–NSP5/6) штаммов РВА. Красным кружком обозначен исследуемый штамм, голубыми кружками – нижегородские штаммы подгруппы ВА222, изученные ранее, оранжевыми треугольниками – прототипные штаммы подгрупп AU-1, Cat97 и ВА222.

Fig. 2. Phylogenetic trees constructed based on nucleotide sequences of: a – structural genes (VP1–VP4, VP6, VP7); b – non-structural genes (NSP1–NSP5/6) of rotavirus A strains. The red circle represents the strain under study, the blue circles represent the previously studied Nizhny Novgorod strains of the BA222 subgroup, and the orange triangles represent the prototype strains of the AU-1, Cat97, and BA222 subgroups.

 

Было установлено, что необычный штамм NN21/23 генотипа G2P[9] является представителем подгруппы ВА222. Он имеет аналогичную констелляцию субгенотипов с нижегородскими РВА генотипа G3P[9], за исключением гена VP7 (табл. 1).

 

Таблица 1. Геномные констелляции нижегородских РВА на уровне субгенотипов

Table 1. Genomic constellations of Nizhny Novgorod rotaviruses at the subgenotype-level

Штаммы / Strains	Сегменты генома / Genome segments
	VP7	VP4	VP6	VP1	VP2	VP3	NSP1	NSP2	NSP3	NSP4	NSP5/6
Референтные штаммы подгрупп AU-1, Cat97 и BA222 / Reference strains of subgroups AU-1, Cat97 and BA222
Human-tc/JPN/AU-1/1982	G3-3-e	P[9]	I3	R3	C3	M3	A3	N3	T3	E3	H3
Cat-wt/AUS/Cat97/1984	G3-3-e	P[3]	I3	R3	C2-IX	M3	A9	N2-XVI	T3	E3	H6
Cat-wt/ITA/BA222/2005	G3-3-e	P[9]	I2-XIV	R2-XIII	C2-IX	M2-XI	A3	N1	T3	E2-XVII	H3
Нижегородские штаммы, подобные РВ кошек, выявленные ранее / Nizhny Novgorod strains similar to feline RV, previously identified
NN1061/16	G6-I	P[9]	I2-XIV	R2-XIII	C2-IX	M2-XI	A3	N2-XVI	T3	E2-XVII	H3
NN148/17	G3-3-e	P[9]	I2-XIV	R2-XIII	C2-IX	M2-XI	A3	N2-XVI	T3	E3	H3
NN2748/18	G3-3-e	P[9]	I2-XIV	R2-XIII	C2-IX	M2-XI	A3	N2-XVI	T3	E3	H3
NN2853/21	G3-3-e	P[9]	I2-XIV	R2-XIII	C2-IX	M2-XI	A3	N2-XVI	T3	E3	H3
NN2885/21	G3-3-e	P[9]	I2-XIV	R2-XIII	C2-IX	M2-XI	A3	N2-XVI	T3	E3	H3
NN347/22	G3-3-e	P[9]	I2-XIV	R2-XIII	C2-IX	M2-XI	A3	N2-XVI	T3	E3	H3
NN2619/22	G3-3-e	P[9]	I2-XIV	R2-XIII	C2-IX	M2-XI	A3	N2-XVI	T3	E3	H3
NN1473/21	G2-IVa-3	P[4]-IV	I2-XIV	R2-XIII	C2-IX	M2-XI	A3	N2-XVI	T3	E2-XVII	H3
NN2924/21	G2-IVa-3	P[4]-IV	I2-XIV	R2-XIII	C2-IX	M2-XI	A3	N2-XVI	T3	E3	H2-IVa
Штамм, описанный в данной работе / Strain described in this work
NN21/23	G2-IVa-3	P[9]	I2-XIV	R2-XIII	C2-IX	M2-XI	A3	N2-XVI	T3	E3	H3

Примечание. Серым цветом отмечены DS-1-подобные аллели, зеленым – AU-1-подбные аллели.

Note. DS-1-like alleles are marked in gray, while AU-1-like alleles are marked in green.

 

Непосредственно с прототипным штаммом ВА222 изолят NN21/23 разделял 8 из 11 генов (VP1–VP4, VP6, NSP1, NSP3 и NSP5/6) (табл. 1). Наибольший уровень сходства нуклеотидных последовательностей был установлен для VP1, VP2, NSP3 и NSP5/6 (98,2–99,8%). Для остальных генов (VP3, VP4, VP6, NSP1) был показан низкий уровень гомологии в пределах 93,2–97,2%. Что касается генов VP7, NSP2 и NSP4, для них были показаны другие генотипы (G2, N2 и E3 соответственно), отличные от таковых у штамма ВА222 (табл. 1).

По большинству генов (9 из 11: VP1–VP4, VP6, NSP1, NSP2, NSP4 и NSP5/6) исследуемый штамм был тесно связан с РВА генотипа G3P[9], циркулировавшими в Китае в 2019–2023 гг. (Fuzhou22-38, Fuzhou23-3, BJ-F2086 и SC24-002ds) (рис. 2). Уровень сходства их нуклеотидных последовательностей находился в пределах 99,5–100,0%. Стоит отметить, что сходство с нижегородскими штаммами при этом не превышало 99,1%.

По гену NSP3 NN21/23 показал близкое родство с нижегородскими штаммами, подобными РВ кошек и собак генотипов G2P[4], G3P[9] и G6P[9], выявленными в 2016–2022 гг. (99,6–99,8%), а также с прототипным штаммом ВА222 (99,8%) (рис. 2).

Дивергентный ген VP7 был общим с таковыми у изолятов генотипа G2P[4] из Нижнего Новгорода (2016–2021 гг.), в том числе с РВА, подобными РВ кошек и собак NN1473/21 и NN2924/21, а также c изолятами 2016–2018 гг. из Новосибирска (99,2–99,4%) (рис. 2).

Анализ нуклеотидных и аминокислотных последовательностей. Учитывая тесную связь изолята NN21/23 с РВА из Китая по 9 из 11 генов, было бы интересно провести сравнительный анализ их нуклеотидных и аминокислотных последовательностей с аналогичными характеристиками нижегородских РВА подгруппы ВА222 2016–2022 гг.

При анализе нуклеотидных последовательностей генов VP1–VP4, VP6, NSP1, NSP2, NSP4 и NSP5/6 были выявлены 43 нуклеотидные замены, отличающие исследуемый штамм NN21/23 и РВА из Китая от нижегородских представителей подгруппы ВА222 (табл. 2). Максимальная частота мутаций была зафиксирована в генах VP3, VP4 и NSP1, где число выявленных нуклеотидных замен колебалось от 6 до 18. Менее вариабельными оказались гены VP1, VP2 и VP6, для которых было установлено 3–4 замены. Наиболее стабильными были неструктурные гены NSP2, NSP4 и NSP5/6, демонстрирующие лишь единичные случаи замен.

 

Таблица 2. Особенности нуклеотидных последовательностей генов VP1–VP4, VP6, NSP1, NSP2, NSP4 и NSP5/6, отличающие РВА подгруппы ВА222 из Нижнего Новгорода и Китая

Table 2. Features of the nucleotide sequences of the genes VP1–VP4, VP6, NSP1, NSP2, NSP4 and NSP5/6 that distinguish RVA subgroup BA222 from Nizhny Novgorod and China

Ген Gene	VP1			VP2				VP3						VP4																		VP6			NSP1						NSP2	NSP4	NSP5/6
Позиция Position	1752	1753	2199	2292	2343	2643	2744	1984	2210	2269	2447	2482	2504	38	39	40	41	42	154	168	174	264	268	303	383	391	396	468	474	639	745	272	356	377	306	326	400	559	560	568	443	492	516
Нижний Новгород, 2016–2022 гг., ВА222-подобные РВА генотипов G2P[4], G3P[9], G6P[9] Nizhny Novgorod, 2016-2022, VA222-like RVA of genotypes G2p[4] and G6P[9]	T	A	T	G	T	C	T	T	T	G	C	T	T	A	T	A	T	C	A	C	G	A	A	G	A	T	T	T	C	A	A	T	A	A	A	C	T	T	C	G	T	G	T
	.	.	.	.	.	.	.	.	.	.	.	.	.	.	.	.	.	.	.	.	.	.	.	.	.	.	.	.	.	.	.	.	.	.	.	.	.	.	.	.	.	.	.
	.	.	.	.	.	.	.	.	.	.	.	.	.	.	.	.	.	.	.	.	.	.	.	.	.	.	.	.	.	.	.	.	.	.	.	.	.	.	.	.	.	.	.
	.	.	.	.	.	.	.	.	.	.	.	.	.	.	.	.	.	.	.	.	.	.	.	.	.	.	.	.	.	.	.	.	.	.	.	.	.	.	.	.	.	.	.
	.	.	.	.	.	.	.	.	.	.	.	.	.	.	.	.	.	.	.	.	.	.	.	.	.	.	.	.	.	.	.	.	.	.	.	.	.	.	.	.	.	.	.
	.	.	.	.	.	.	.	.	.	.	.	.	.	.	.	.	.	.	.	.	.	.	.	.	.	.	.	.	.	.	.	.	.	.	.	.	.	.	.	.	.	.	.
	.	.	.	.	.	.	.	.	.	.	.	.	.	.	.	.	.	.	.	.	.	.	.	.	.	.	.	.	.	.	.	.	.	.	.	.	.	.	.	.	.	.	.
	.	.	.	.	.	.	.	.	.	.	.	.	.	.	.	.	.	.	.	.	.	.	.	.	.	.	.	.	.	.	.	.	.	.	.	.	.	.	.	.	.	.	.
	.	.	.	.	.	.	.	.	.	.	.	.	.	.	.	.	.	.	.	.	.	.	.	.	.	.	.	.	.	.	.	.	.	.	.	.	.	.	.	.	.	.	.
Китай, 2019–2023 гг., G3P[9] China, 2019-2023, G3P [9]	C	G	A	A	C	T	C	C	C	A	T	C	G	T	A	T	C	A	G	T	A	G	G	A	G	C	C	A	T	G	G	C	G	G	G	T	C	C	T	A	C	A	C
	C	G	A	A	C	T	C	C	C	A	T	C	G	T	A	T	C	A	G	T	A	G	G	A	G	C	C	A	T	G	G	C	G	G	G	T	C	C	T	A	C	A	C
	C	G	A	A	C	T	C	C	C	A	T	C	G	T	A	T	C	A	G	T	A	G	G	A	G	C	C	A	T	G	G	C	G	G	G	T	C	C	T	A	C	A	C
	C	G	A	A	C	T	C	C	C	A	T	C	G	T	A	T	C	A	G	T	A	G	G	A	G	C	C	A	T	G	G	C	G	G	G	T	C	C	T	A	C	A	C
NN21/23 G2P[9]	С	G	A	A	C	T	C	C	C	A	T	C	G	T	A	T	C	A	G	T	A	G	G	A	G	C	C	A	T	G	G	C	G	G	G	T	C	C	T	A	C	A	C

Примечание. Серым цветом отмечены несинонимичные замены.

Note. Non-synonymous substitutions are marked in gray.

 

Было установлено, что 13 замен в позициях A1753G для гена VP1, T2210C и T2504G – для VP3, A38T, T39A, A40T, T41C, C42A, A154G, A268G, A383G, A745G – для VP4 и A306G – для гена NSP1 являются несинонимичными, поскольку приводят к изменениям в аминокислотной последовательности данных белков.

При анализе выведенных аминокислотных последовательностей белков VP1, VP3, VP4 и NSP1 было выявлено 10 замен, 8 из которых были радикальными (отмечены серым цветом), и, вероятно, могли влиять на структуру и функции вирусных белков (Таблица 3).

 

Таблица 3. Замены в аминокислотных последовательностях белков VP1, VP3, VP4 и NSP1 РВА подгруппы ВА222 из Нижнего Новгорода и Китая

Table 3. Substitutions in the amino acid sequences of proteins VP1, VP3, VP4 and NSP1 RVA subgroup BA222 from Nizhny Novgorod and China

Белок / Protein	VP1	VP3		VP4						NSP1
Позиция / Position	585	737	835	13	14	52	90	128	249	102
Нижний Новгород, 2016–2022 гг., ВА222-подобные РВА генотипов G2P[4], G3P[9], G6P[9] Nizhny Novgorod, 2016-2022, VA222-like RVA of genotypes G2P[4], G3P[9], and GP6[9]	N (Asn)	F (Phe)	F (Phe)	Y (Tyr)	I (Ile)	N (Asn)	T (Thr)	N (Asn)	I (Ile)	K (Lys)
Китай, 2019–2023 гг., ВА222-подобные РВА генотипа G3P[9] China, 2019-2023, VA222-like RVA of genotype G3P[9] Нижний Новгород, 2023 г., ВА222-подобный РВА NN21/23 генотипа G2P[9] Nizhny Novgorod, 2023 г., VA222-like RVA NN21/23 of genotype G2P[9]	D (Asp)	L (Leu)	V (Val)	L (Leu)	S (Ser)	D (Asp)	A (Ala)	S (Ser)	V (Val)	R (Arg)

Примечание. Серым цветом отмечены радикальные замены.

Note. Radical substitutions are marked in gray.

 

Белок VP1 выполняет роль РНК-зависимой РНК-полимеразы. Установленная нами радикальная замена в позиции N585D была расположена в регионе активного центра полимеразы (аминокислоты 333–778), в субдомене «пальцев» (аминокислоты 333–488, 524–595) [31].

Белок VP3 является ферментом гуанилил-трансферазой. Он катализирует образование кэп-структуры на 5’-конце во время процессинга пре-мРНК, синтезированных полимеразой VP1, тем самым стабилизируя вирусную мРНК и защищая ее от утилизации нуклеазами. В нашем случае обе радикальные замены в позициях F737L и F835V находились в районе домена PDE (phosphodiesterase-like domain, аминокислоты 694–835). Этот домен в комплексе с белком VP1 участвует в процессах репликации и транскрипции ротавирусной РНК, способен изменять вторичные структуры РНК, важен для распознавания и связывания с матрицами РНК [32].

Белок VP4 представляет собой шип на поверхности вирусной частицы. При проникновении вирусной частицы в клетку фермент трипсин расщепляет его на субъединицы VP8* (аминокислоты 1–247) и VP5* (аминокислоты 248–776). Пять выявленных радикальных замен в аминокислотной последовательности белка VP4 в позициях Y13L, I14S, N52D, T90A и N128S располагались в области субъединицы VP8*. Субъединица VP8* обладает гемагглютинирующей активностью, участвует в связывании сиаловой кислоты хозяина, играет определяющую роль в тропизме вируса и является главной мишенью для вируснейтрализующих антител [33]. Все замены находились в промежутке между 1 и 150 аминокислотами, что соответствует домену глобулярной головки или «ядру» в структуре VP8* [34].

Обсуждение

РВА с редким генотипом G2P[9] и констелляцией внутренних генов I2-R2-C2-M2-A3-N2-T3-E3-H3 был выявлен в Нижнем Новгороде и охарактеризован на основе всех сегментов генома впервые.

Анализ аминокислотных последовательностей выявил радикальные замены в функционально-активных регионах структурных белков VP1, VP3 и VP4. Так, замена N585D в белке VP1 находилась в субдомене «пальцев» активного центра. Изменения в данном регионе могут повлиять на обеспечение точности и эффективности процессов репликации и транскрипции РНК РВ, в том числе формирование активных центров, обеспечивающих присоединение рибонуклеотидов к растущей цепи РНК, распознавание и стабилизацию взаимодействия полимеразы с матрицей РНК, адаптацию к различным конфигурациям РНК-матрицы. Это, в свою очередь, способно отразиться на скорости размножения вируса и его способности адаптироваться к различным условиям внутри клетки-хозяина [31].

В белке VP3 были обнаружены две радикальные замены F737L и F835V в районе домена PDE (phosphodiesterase-like domain). Этот домен в комплексе с белком VP1 участвует в процессах репликации и транскрипции ротавирусной РНК, способен изменять вторичные структуры РНК, важен для распознавания и связывания с матрицами РНК. Любые мутации, затрагивающие структуру этого домена, могут снизить или нарушить формирование эффективного репликативного аппарата, замедляя рост популяции вируса в инфицированных клетках [32].

Наиболее значимые изменения были выявлены в поверхностном белке VP4, который состоит из двух субъединиц VP8* и VP5*. Пять радикальных замен (Y13L, I14S, N52D, T90A и N128S) были локализованы в субъединице VP8*, а именно в домене глобулярной головки. Именно там находятся ключевые участки, необходимые для связывания с рецепторами клетки-хозяина, а изменения в структуре данного региона могут существенно изменить его способность проникать в клетки и распространяться в популяции. Кроме того, этот домен является основной мишенью для вируснейтрализующих антител, поэтому выявленные мутации могут влиять на антигенные свойства штамма и способствовать уклонению от иммунного ответа [33].

В литературе упоминается о спорадической циркуляции единичных штаммов данного генотипа на территории других стран. К примеру, при изучении популяции РВА методом G[P]-типирования в Южной Корее в период 2004–2006 гг. было выявлено три штамма генотипа G2P[9] [35]. Похожая картина наблюдалась в Турции, где в 2022 г. было зарегистрировано пять случаев выявления представителей данного генотипа [36]. Также циркуляция РВА редкого генотипа G2P[9] в 2014 г. отмечалась в Нигерии [37]. Однако более подробного изучения штаммов не проводилось.

Данные о генетических особенностях изолятов генотипа G2P[9] в литературе отсутствуют. В России и в мире сообщений об изучении аналогичных штаммов ранее не представлено.

Заключение

В настоящем исследовании представлена молекулярная характеристика нижегородского реассортантного РВА с «широким» профилем РНК в ПААГ, который являлся представителем подгруппы ВА222. Штамм с редким генотипом G2P[9] был охарактеризован на основе полного генотипа впервые в России и в мире.

Результаты филогенетического анализа свидетельствуют о сложной эволюционной природе данного изолята, потенциально включающей события реассортации между нижегородскими Wa- и ВА222-подобными РВА, а также изолятами генотипа G3P[9] из Китая (2019–2023 гг.).

Изученный нами штамм NN21/23 и китайские изоляты, в отличие от нижегородских ВА222-подобных РВА 2016–2022 гг., имели 43 нуклеотидные замены в генах VP1–VP4, VP6, NSP1, NSP2, NSP4 и NSP5/6, 13 из которых были несинонимичными. Они стали причиной 10 аминокислотных замен в белках VP1, VP3, VP4 и NSP1, 8 из которых были радикальными. Радикальные замены располагались в функционально-активных регионах белков VP1, VP3 и VP4, которые играют ключевую роль в репликативном цикле РВ.

Накопление точечных мутаций в аминокислотных последовательностях как структурных, так и неструктурных вирусных белков может повлиять на выполняемые ими функции. Так, например, изменения в структуре белка NSP1 могут стать причиной формирования наиболее активно реплицирующегося варианта, а модификации антигенных детерминант белка VP4 внешней оболочки РВ может привести к выходу варианта из-под влияния вакцинопрофилактики.

About the authors

Elena I. Velikzhanina

Academician I.N. Blokhina Nizhny Novgorod Scientific Research Institute of Epidemiology and Microbiology of the Federal Service for Supervision of Consumer Rights Protection and Human Welfare (Rospotrebnadzor)

Email: www.e_velikzhanina@mail.ru
ORCID iD: 0000-0003-4069-1427

Junior Researcher, Laboratory of Molecular Epidemiology of Viral Infections

Russian Federation, Nizhny Novgorod

Tatiana A. Sashina

Academician I.N. Blokhina Nizhny Novgorod Scientific Research Institute of Epidemiology and Microbiology of the Federal Service for Supervision of Consumer Rights Protection and Human Welfare (Rospotrebnadzor)

Email: tatyana.sashina@gmail.com
ORCID iD: 0000-0003-3203-7863

PhD, Senior Researcher, Laboratory of Molecular Epidemiology of Viral Infections

Russian Federation, Nizhny Novgorod

Alexander Y. Kashnikov

Academician I.N. Blokhina Nizhny Novgorod Scientific Research Institute of Epidemiology and Microbiology of the Federal Service for Supervision of Consumer Rights Protection and Human Welfare (Rospotrebnadzor)

Email: a.kashn@yandex.ru
ORCID iD: 0000-0003-1033-7347

Research Scientist, Laboratory of Molecular Epidemiology of Viral Infections

Russian Federation, Nizhny Novgorod

Natalia V. Epifanova

Academician I.N. Blokhina Nizhny Novgorod Scientific Research Institute of Epidemiology and Microbiology of the Federal Service for Supervision of Consumer Rights Protection and Human Welfare (Rospotrebnadzor)

Email: epifanovanv@mail.ru
ORCID iD: 0000-0001-7679-8029

PhD, Leading Researcher, Laboratory of Molecular Epidemiology of Viral Infections

Russian Federation, Nizhny Novgorod

Nadezhda A. Novikova

Academician I.N. Blokhina Nizhny Novgorod Scientific Research Institute of Epidemiology and Microbiology of the Federal Service for Supervision of Consumer Rights Protection and Human Welfare (Rospotrebnadzor)

Author for correspondence.
Email: novikova_na@mail.ru
ORCID iD: 0000-0002-3710-6648

Doctor of Science, Professor, Leading Researcher, Head of the Laboratory of Molecular Epidemiology of Viral Infections

Russian Federation, Nizhny Novgorod

References

Supplementary files